Введение
Все элементы под контролем: как технология LA-LIBS революционизирует анализ биологических тканей
В мире аналитической химии стремительно растёт интерес к точным, пространственно-разрешённым методам, способным одновременно обеспечивать высокую чувствительность и широкий элементный охват. Одним из таких методов стала лазерная абляция с индуктивно связанной плазмой и масс-спектрометрией (LA-ICP-MS). Этот метод по праву считается одним из самых мощных инструментов для микроэлементного и изотопного анализа биологических образцов. Однако, несмотря на высокую точность и чувствительность, LA-ICP-MS сталкивается с рядом серьёзных ограничений при попытке анализа основных (базовых) элементов, таких как углерод (C), водород (H), кислород (O) и азот (N).
Главная проблема — изобарические помехи и высокий фон, мешающие корректному определению неметаллов. Именно эти элементы, впрочем, составляют основу органических тканей, что делает их надёжный анализ критически важным для биологических и медицинских исследований.
Здесь на сцену выходит другой метод — лазерно-индуцированная пробойная спектроскопия (LIBS). LIBS позволяет легко регистрировать сигналы от водорода, кислорода, углерода и азота, благодаря регистрации оптического спектра эмиссии, но при этом менее эффективен при анализе следовых концентраций редких элементов.
Так стоит ли выбирать между точностью и охватом?
Компания Applied Spectra решила этот вопрос радикально, предложив уникальную гибридную платформу J200 Tandem LA-LIBS, которая сочетает в себе два метода — LA-ICP-MS и LIBS — в одном приборе. Благодаря синхронному получению оптического и масс-спектра от одного и того же лазерного импульса, пользователи получают полноценную картину состава образца: от основных неметаллов до редкоземельных элементов, от распределения микроэлементов до изотопных соотношений.
Преимущества подхода Tandem LA-LIBS:
-
Максимальный элементный охват: от H, C, N, O до U и других тяжёлых металлов.
-
Снижение аналитических ограничений: устранение недостатков каждого метода по отдельности.
-
Пространственно-разрешённый анализ: возможность картирования тканей и микроструктур.
-
Высокая скорость анализа: синхронная регистрация двух типов данных с одного импульса.
Интеграция LA-ICP-MS и LIBS открывает новые горизонты для исследователей, работающих с биоматериалами, фармацевтическими образцами, археологическими находками и даже продуктами питания. Это технологическое решение позволяет проводить глубокий и многомерный анализ без компромиссов.
Если вы ищете технологию, способную раскрыть максимум информации об исследуемом объекте — J200 Tandem LA-LIBS станет вашим незаменимым помощником.
Следите за нашими публикациями, чтобы быть в курсе последних достижений в области аналитической спектроскопии!
Представление лазерной абляции как процесса прямого отбора твердой пробы с последующим анализом фотонов из индуцированной плазмы с использованием лазерно-индуцированной эмиссионной спектроскопии (LIBS) и путем транспортировки аблированной массы в индуктивно-связанную плазму (ICP) с масс-спектрометрией (MS).
Лазерный луч может быть плотно сфокусирован в пятно диаметром в несколько микрометров. Соответственно, измерения Tandem LA‒LIBS обеспечивают высокую четкость изображения с очень высокой чувствительностью для следовых элементов в каждом пространственном месте, куда направлены импульсы лазерной абляции. Tandem LA‒LIBS может выполнять 2D (или 3D, слой за слоем по глубине) химические карты, которые представляют количественно определенные распределения элементов в биологических образцах.
Элементарная визуализация в клеточном диапазоне становится возможной при корреляции или нормализации по плотности и составу органической матрицы. Это особенно важно для патологических опухолей, подвергаемых исследованию эффективности противораковых препаратов. Высокое пространственное разрешение химической визуализации необходимо, поскольку раковые клетки распределены неравномерно, образуя гетерогенные кластеры различной формы и размера.
Другие методы, которые в настоящее время используются для тонкой элементной биовизуализации, основаны на рентгеновских лучах (μXRF, μPIXE, SEM-EDX, XFM) или высокотехнологичной масс-спектрометрии (nano-SIMS, FT-TIMS). Первые требуют либо синхротронного излучения, либо радиоактивных или протонных источников. Последние требуют помещения образца в вакуумную камеру. Хотя эти подходы могут обеспечить субмикронное разрешение, Tandem LA‒LIBS имеет более широкий элементный и изотопный охват, более широкий пространственный диапазон, работает проще и быстрее и хорошо подходит для количественной визуализации тканей, целых органов и структур органов, процессов метаболизма, моделей роста, поглощения наночастиц, транспорта, анализа белков и отдельных клеток. Tandem LA‒LIBS может включать только минимальную подготовку образца или не включать ее вовсе.
Инструмент J200 LA-LIBS от Applied Spectra
Ниже приведено несколько примеров использования прибора J200 Tandem LA‒LIBS для биовизуализации.
Визуализация плевральной мезотелиомы человека
Инструмент J200 Tandem LA‒LIBS, оснащенный наносекундным импульсным лазером Nd:YAG, работающим на четвертой гармонике (266 нм), использовался для картирования среза опухоли человека от человека, ранее лечившегося цисплатином в качестве противоракового препарата. Инструмент J200 Tandem включал широкополосный 6-канальный оптический спектрометр (охватывающий 190‒1040 нм), оснащенный многоканальными детекторами CCD. Анализ ICP-MS выполнялся с помощью прибора Thermo iCAP Q. Срез опухоли сканировался сфокусированным лазерным лучом в линейном режиме сканирования с использованием расстояний между линиями, равных размеру кратера абляции (Ø40 мкм). Латеральное разрешение 40 мкм было достаточным для медицинской интерпретации результатов, но дальнейшее увеличение разрешения неоправданно увеличило бы общее время измерения. 1 Полученные изображения распределения для выбранных элементов показаны на рисунке 1.
Измерения Tandem LA‒LIBS привели к получению изображений микроэлементов (Pt, P, Fe, Zn, Cu), полученных с помощью LA-ICP-MS, а также обильных элементов (C, H, O, Na, K, Ca, Mg), полученных с помощью LIBS в то же время. Углерод и водород были распределены довольно однородно по объему ткани. Некоторые изменения в спектральной интенсивности C и H, вероятно, указывают на различную плотность ткани в соответствующих местах. Коэффициент корреляции для сигналов C и H составил 0,96, что указывает на постоянное соотношение C/H по всей ткани. Фосфор и кислород были распределены неравномерно, но хорошо коррелировали с областями опухоли и друг с другом. Это можно объяснить повышенным содержанием фосфатов, фосфолипидов, ДНК и активированных белков (фосфорилированных аминокислот) в областях опухоли.
Zn и Cu продемонстрировали схожие распределения, выступая в качестве известных кофакторов белков. Концентрация железа была переменной и не была связана с другими распределениями.
Платина, доставляемая цисплатином, накапливается в основном в здоровой ткани. Может возникнуть механизм резистентности, затрудняющий усвоение препарата и требующий больше времени для проникновения в область опухоли.
Na и K были довольно однородно распределены (не показано на рис. 1) с хорошей корреляцией друг с другом. Эти два элемента имеют схожие биологические функции по поддержанию мембранного давления в клетках. Mg и Ca также играют схожие физиологические роли, и поэтому они продемонстрировали схожие распределения (не показано на рис. 1).
Дальнейшее исследование подтвердило идеальную корреляцию между изображениями натрия, полученными с помощью LA-ICP-MS на массе 23 Na и LIBS на оптической эмиссионной линии Na 589 нм. Эти два распределения натрия были численно сравнены, что дало коэффициент корреляции Пирсона R = 0,918, что продемонстрировало превосходную надежность результатов. 2
Визуализация цельной кожи свиньи in vitro
Наночастицы серебра широко используются в косметике и средствах по уходу за кожей. Возможность проникновения Ag через поврежденную или ссадину кожи (воспаления, раны, чрезмерный солнечный свет и регулярное бритье) поднимает обоснованные вопросы о безопасности потребителя. Прибор J200 Tandem LA-LIBS с наносекундным твердотельным лазером Nd:YAG, работающим на длине волны 266 нм, использовался для картирования верхних слоев эпидермиса изолированных образцов кожи свиньи. 3 В этом исследовании анализ ICP-MS проводился с помощью прибора Bruker Aurora Elite.
После воздействия наночастиц серебра образцы кожи были помещены в парафин и просканированы лазерным лучом (Ø35 мкм) в шаблоне линейного сканирования с расстоянием между линиями 70 мкм. Образцы кожи были подвергнуты воздействию наночастиц Ag, стабилизированных цитратом (45 нм), в концентрациях 47, 470 и 750 мкг/мл, а также смешивались с другими популярными косметическими ингредиентами. Частота повторения лазерных импульсов составляла 10 Гц. Количественные элементарные изображения для Ag, C, P и S представлены на рисунке 2. Сигнал углерода от парафина был вычтен.
Сильные сигналы Ag были обнаружены в роговом слое эпидермиса и в волосяных фолликулах. Не было обнаружено четких тенденций поглощения серебра в коже между концентрациями и размерами нанесенных наночастиц Ag.
Однако более крупные наночастицы серебра, смешанные с химическими веществами, используемыми в косметических формулах, демонстрируют более низкую проникающую способность.
Максимальное количество Ag, проникшего в кожу, составило 0,45 нг/см2 , что было измерено методом LA-ICP-MS с использованием прибора J200 Tandem LA-LIBS.
Визуализация мозга крысы in vitro
Неврологические функции включают биохимию металлов в мозге, и их распределение отражает детали архитектуры мозга. Пример использования модели инструмента J200 Tandem LA-LIBS для элементного картирования полушарий мозга крысы показан на рисунке 3. Показатели обрабатывались с помощью Mn, вводимого либо в виде наночастиц, либо в виде раствора MnCl2 , который часто используется в качестве контрастного вещества и маркера для магнитно-резонансной томографии.
Медь и цинк — два металла, связанных с заболеваниями в мозге. Mn, Cu и Zn измерялись с использованием протокола, похожего на анализ всей свиной кожи (см. выше). Результаты показали, что наночастицы Mn имели тенденцию накапливаться и дольше оставались в мозге крыс, чем раствор MnCl 2 .
Цинк является необходимым микроэлементом для работы мозга. Цинк может подавлять инфекцию благодаря содержащим Zn цитокинам, выделяемым клетками мозга.
Высокие дозы меди могут быть токсичны из-за ее способности изменять степень окисления в окислительно-восстановительных реакциях.
Картографирование загрязненных листьев
Детальное элементное картирование вегетативных органов может быть использовано для определения путей поглощения доступных питательных веществ, токсичных элементов из загрязнения окружающей среды, последствий изменения климата и жизненных функций растений. Инструмент J200 Tandem LA‒LIBS с наносекундным твердотельным Nd:YAG
Для картирования листьев растений, подвергшихся воздействию раствора загрязняющего вещества, использовался лазер с длиной волны 266 нм. Анализ ICP-MS проводился с помощью прибора Analytik Jena PlasmaQuant Elite. Листья сканировались с использованием лазерного пятна размером 150 мкм. Полученные элементарные изображения показаны на рисунке 4.
Загрязнители (Zn, Cu, Ni) были обнаружены в основном в средней жилке, жилке и капиллярах. Основные питательные вещества (Mg, H, K, Ca) были распределены относительно равномерно по структуре листа. Чувствительность LIBS для Ca велика, но может быть низкой в ICP-MS, поскольку основной изотоп 40 Ca маскируется 40 Ar в работе ICP.
Фемтосекундная LA-ICP-MS и LIBS визуализация
Прибор J200 Femto iX Tandem LA‒LIBS с фемтосекундным лазерным источником на основе технологии накачки на основе иттербиевого диода, работающий на длине волны 343 нм, использовался для картирования образца опухоли легкого человека от пациента, получавшего цисплатин.
Фемтосекундные лазеры идеально подходят для химической визуализации высокой четкости, поскольку они могут создавать на порядок меньшие и более правильно сформированные абляционные ячейки, чем наносекундные лазеры. Таким образом, пространственное разрешение в визуализации значительно улучшается.
Кроме того, фемтосекундные лазеры оказывают меньшую тепловую нагрузку на образец и подавляют нелинейные матричные эффекты. Это приводит к смягчению требований к калибровке стандарта, соответствующего матрице. Фемтосекундная лазерная абляция генерирует более мелкие частицы, которые более эффективно транспортируются в ICP-MS и более полно ионизируются ICP. Все эти преимущества приводят к более высокой чувствительности, повышенной точности и достоверности химического анализа по сравнению с наносекундной лазерной абляцией.
На рисунке 5 показаны результаты картирования образца опухоли с использованием прибора J200 Femto iX Tandem. Платина ( 194 Pt) была измерена методом ICP-MS на уровне следов <20 мкг/г, а углерод был измерен методом LIBS при концентрации >25 мас.%. Диаметр лазерного луча составил 10 мкм. Элементарное разрешение изображения было значительно улучшено по сравнению с изображениями, показанными на рисунке 1.
Прибор J200 Femto iX Tandem LA‒LIBS компактен и в то же время очень эффективен.
