Категория: Блог
Просмотров: 537
Чужеродные и инвазивные растения угрожают целостности природных экосистем, поскольку большинство из них являются инвазивными, конкурируют с местными растениями и во многих случаях занимают их место в экосистеме. Инвазивные виды характеризуются быстрым распространением за счет производства большого количества потомства, которое может рассеиваться на большие расстояния [ 1 ]. Более того, они имеют высокую выживаемость благодаря своей пластичности, способной реагировать на различные условия окружающей среды. Кроме того, некоторые природные явления могут способствовать их распространению, например, наводнения, ветер, поверхностная эрозия и т. д.
На распространение инвазивных видов также существенно повлияла деятельность человека [ 2 ]. С древних времен чужеродные растения случайно или намеренно переносились в новые места обитания и культивировались как садовые или декоративные растения [ 3 ]. Их распространению способствует также деятельность человека, роль которой двоякая: транспортировка размножающегося материала и изменение среды обитания. Главное преимущество заключается в том, что у них нет физических врагов, которые бы контролировали их население, чтобы они в полной мере использовали свой конкурентный потенциал. Некоторые инвазивные растения также развивают новые механизмы взаимодействия с природными экосистемами [ 4 ]. Одним из таких механизмов является продукция аллелопатических веществ и их выброс в экосистему [ 5].
Amorpha L. ( Fabaceae Juss.: Amorpheae Britains .) — род из 16 видов, произрастающих в Северной Америке [ 6 ]. Эти растения могут представлять собой кустарники, полукустарники или травянистые многолетние растения и встречаются в различных средах обитания, включая прибрежные коридоры, саванны и луга. Многие виды Amorpha имеют очень ограниченное распространение, а некоторые считаются находящимися под угрозой исчезновения [ 7 ].
Amorpha fruticosa L. (куст индиго) — многолетний листопадный кустарник, принадлежащий к семейству Fabaceae и произрастающий в юго-западной части Северной Америки [ 8 ]. Куст индиго был завезен в Европу как декоративное растение [ 5 ]. Его используют как лекарство для лечения ожогов и экземы [ 9 ]. В последние годы ему уделяется особое внимание из-за его биологической активности. Исследования показали, что это растение богато полифенолами и содержит биологически активные ингредиенты. Он также обладает противораковой, противовоспалительной и противомикробной активностью [ 10] .]. Куст индиго – растение, имеющее большую декоративную ценность и используемое при обустройстве городских ландшафтов и при охране склонов. Он может выжить в сухих почвах, но предпочитает берега рек и опушки затопленных лесов, где легко распространяется водой, поскольку его семенные коробочки плавучие [11 ] . Его высокая толерантность к различным климатическим условиям, а также отличная способность к размножению дают ему возможность с легкостью расти за пределами своего естественного распространения [ 12 ]. Сегодня он признан одним из наиболее инвазивных видов в Европе, оказывающим серьезное воздействие на местные экосистемы [ 11 ]. Это светолюбивое растение, конкурирующее за свет, образующее густые заросли, затмевающие местную флору, а это приводит к снижению биоразнообразия [ 11, 12 , 13 ]. Из-за ущерба, который он наносит природным экосистемам и водному хозяйству, следует немедленно принять меры по сокращению/контролю его популяции.
В Греции трансграничные реки, такие как Нестос, Аксиос и др., являются транспортными коридорами для чужеродных видов растений, которые расширяют свой ареал за счет воды [ 14 ]. Однако, помимо конкретного вида транспорта, в последние годы в Грецию были интродуцированы многие зарубежные виды растений, как намеренно (например, декоративные и лекарственные растения), так и непреднамеренно, используя различные способы интродукции [2 ] . Хотя число чужеродных видов велико, не все из них являются инвазивными. Из 343 чужеродных видов только 50 проявляют инвазионное поведение, и большинство из них имеют американское происхождение [ 15 ].
Нестос — трансграничная река Болгарии и Северной Греции. Берет начало от горы Рила на юге Болгарии и проходит между горными хребтами Аймос и Родопы. Его длина составляет 234 км, из них 130 км находится на территории Греции [ 16 ]. Прежде чем впасть в море, он простирается через равнину Хрисуполис и расширяется как дельтовая система с пресноводными озерами, образующими дельту Нестоса. В этой зоне существует приоритетная среда обитания 91E0 (Приложение I Директивы 92/43/EEC), в которой представлены два подтипа: подтип ольховых насаждений ( Alnus Glutinosa ) и подтип тополя белого ( Populus alba ) и вяза ( Ulmusminor ).) стоит. Первый подтип состоит из чистых насаждений ольхи, произрастающих на легких и умеренно легких почвах с очень хорошими физическими свойствами, которые можно охарактеризовать как Calcaric fluvisols. При этом уровень грунтовых вод относительно высокий (90–95 см). Этот подтип встречается между дамбами, местами вблизи берегов рек или в местах, удаленных от них на несколько десятков метров. Второй подтип составляет значительную часть тугайного леса и располагается за пределами дамб. Он состоит из насаждений белого тополя и вяза, которые растут на глубоких и умеренно легких почвах с хорошими физическими свойствами, принадлежащих к типу почв Eutric Fluvisol, без проблем с щелочностью и засоленностью. Уровень грунтовых вод низкий, но сильно колеблется [ 17 ].
Территория вдоль реки существенно изменилась со времен Второй мировой войны [ 18 ]. В 1945 году на этой территории преобладали леса и водно-болотные угодья. В 1960-е годы площадь сельскохозяйственных угодий увеличилась, что привело к уменьшению лесных площадей. Также произошло значительное сокращение площади водно-болотных угодий из-за их преобразования в пастбища. Однако, несмотря на сильное упадок природной экосистемы, в этом районе по-прежнему сохраняется самый обширный речной лес в Греции. Кроме того, равнина реки Нестос имеет важное экологическое значение из-за множества важных мест обитания. Он был классифицирован как водно-болотное угодье международного значения и включен в Рамсарскую конвенцию. Он также защищен Бернской конвенцией, директивами Европейской комиссии и законодательством Греции. Кроме того, он принадлежит к сети Natura 2000.19 ].
В Греции Amorpha fruticosa L. считается инвазивным видом, поскольку это растение способно распространяться на обширной территории. В настоящей работе изучено генетическое разнообразие популяций Amorpha fruticosa L., произрастающих вдоль реки Нестос. Наши цели заключались в том, чтобы (1) определить уровень генетической дифференциации, если она существует, между двумя берегами реки: западным и восточным; (2) оценить степень инбридинга в каждой популяции, а также эффективный размер популяции; и (3) обсудить последствия расширения конкретных видов в естественной экосистеме и, более конкретно, в популяциях местных видов в этом районе.

2. Материалы и методы

2.1. Растительный материал

Сбор образцов листьев проведен на 20 особях Amorpha fruticosa из 2 популяций района реки Нестос (ориентировочные координаты западной популяции A: X: 565671, Y: 4527927 и восточной популяции: X: 566918, Y: 4525481). Экстракцию ДНК из свежей хвои проводили с помощью набора Macherey Nagel Plant (Düren, Северный Рейн-Вестфалия, Германия) в соответствии с протоколом производителя.

2.2. Процедура ПФЛП

Всего 200 нг геномной ДНК фрагментировали расщеплением 4 ед. ферментов EcoRI и MseI при температуре 37°С в течение 3 часов. Расщепленные фрагменты ДНК затем объединяли с адаптерами EcoRI и MseI и полученную смесь лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 от New England Biolabs (Ипсвич, Массачусетс, США). Этот этап лигирования проводили при температуре 26°C в течение 3 часов. Полученную в результате этого процесса ДНК использовали в качестве первичной матрицы для анализа AFLP.
Для этапа преамплификации использовали пару праймеров на основе последовательностей адаптеров EcoRI и MseI с дополнительным селективным нуклеотидом на 3'-конце (EcoRI+A и MseI+C). ПЦР с предварительной амплификацией проводили в общем объеме 20 мкл, который содержал 1X буфер Kapa Taq, 0,2 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl 2., 30 нг каждого праймера (EcoRI+A и MseI+C), 1 единица ДНК-полимеразы Taq от Kapa Biosystems (расположена в Уилмингтоне, Массачусетс, США) и 5 ​​мкл разведенных фрагментов ДНК, полученных в результате реакции расщепления и лигирования. . Условия циклирования ПЦР были следующими: начальная денатурация при 95 °С в течение 30 с, затем 32 цикла денатурации при 95 °С в течение 30 с, отжиг при 56 °С в течение 30 с, удлинение при 72 °С в течение 1 мин. и заключительный этап удлинения при 72 ° C в течение 10 минут. Для подтверждения амплификации образец реакции объемом 5 мкл подвергали электрофорезу в агарозном геле, а оставшиеся 15 мкл разбавляли в 5 раз ТЕ-буфером.
Селективную амплификацию проводили в реакционных объемах объемом 10 мкл, состоящих из 3 мкл разбавленной преселективной матрицы, и с использованием тех же условий реакции, что и на стадии преселективной амплификации, за исключением использования 30 нг праймера MseI и 5 нг праймера EcoRI. за реакцию. Программа циклической селективной амплификации осуществлялась с использованием термоциклера BioRad (Hercules, Калифорния, США) по следующей схеме: начальный цикл денатурации при 95 °C в течение 30 с, отжиг при 65 °C в течение 30 с и удлинение при 95 °C в течение 30 с. 72 °С в течение 1 мин. За этим следовали двенадцать циклов денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг, начинающийся при 65°С в течение 30 с и уменьшающийся на 0,75°С в каждом цикле, и удлинение при 72°С в течение 1 мин. Наконец, двадцать три цикла денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг при 56°С в течение 30 с,
Смеси продуктов f-AFLP подвергали денатурации путем обработки их формамидом при температуре 94 °С в течение 2 мин. Впоследствии эти денатурированные смеси разделяли электрофорезом с использованием генетического анализатора ABI Prism 3730xl, который производится Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Использовали десять комбинаций селективных праймеров AFLP. Затем каждый отдельный гибрид исследовали для определения наличия или отсутствия конкретных фрагментов. Размер обнаруженных фрагментов определяли с использованием программы GeneMapper 4.0 вместе с внутренним стандартом, известным как GS 500 LIZ, который также был предоставлен Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров,20 ].

2.3. Индекс регенерации

Присутствие и плотность A. fruticosa оценивались в приоритетном местообитании 91E0* в районе Нестос на северо-востоке Греции ( рис. 1 ). Пятнадцать (15) участков, каждый площадью 706,86 м 2 , были выбраны случайным образом и равномерно размещены по всей территории обитания 91E0*. В дальнейшем был проведен анализ состава и структуры древесных пород на этих участках. A. fruticosa присутствовала на четырех участках из 15, из которых три располагались на западном берегу реки и один на восточном. У особей A. fruticosa измеряли высоту дерева (м), плотность (особей га -1 ) и индекс регенерации (IR) . IR рассчитывали путем умножения плотности A. fruticosa (на м2 ) по средней высоте A. fruticosa (см) и позволяет оценить степень регенерации [ 20 ].
Экология 04 00041 g001
Рисунок 1. Amorpha fruticosa , распространенная на приоритетном местообитании 91Ε0* в дельте Нестоса, на северо-востоке Греции.

2.4. Сбор данных и статистический анализ данных AFLP

Для преобразования информации о размере аллелей, полученной с помощью GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems, США), в двоичный формат использовался макрос AFLP Excel. Этот макрос присваивал значение «1» присутствующим фрагментам и «0» отсутствующим. Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров, подсчитывали и подвергали дополнительному изучению только согласованные фрагменты, попадающие в диапазон от 150 до 500 пар оснований [ 21 ]. Кроме того, GenAlex v6.0 [ 22 ] использовался для расчета таких параметров, как процент полиморфных полос (P), информационный индекс Шеннона (I) и генетическое разнообразие (He). GenAlex v6.0 также использовался для проведения анализа молекулярной дисперсии (AMOVA), а также для расчета генетических расстояний и анализа главных координат (PCoA).
Подробно, анализ главных координат (PCoA) представляет собой многомерный метод, который позволяет находить и отображать основные закономерности в многомерном наборе данных (например, множественных локусах и множественных образцах). Математика сложна, но, по сути, PCoA — это процесс, с помощью которого основные оси вариаций располагаются в многомерном наборе данных. Для многомерных наборов данных каждая последующая ось объясняет пропорционально меньшую часть общей вариации, так что при наличии отдельных групп первые две или три оси обычно выявляют большую часть разделения между ними. Предусмотрено четыре различных варианта: два основаны на преобразовании матрицы расстояний в ковариационную матрицу, а два работают непосредственно на основе входной матрицы расстояний. Матрица расстояний используется как пул для расчета распределения по осям [22 ].

2.5. Информация о среде обитания 91E0*

Местообитание 91E0* в дельте реки Нестос простирается на небольших высотах (<100 м над уровнем моря) с поверхностями от умеренного до плоского рельефа (уклон 0–10%) (выборка личных данных Коракаки Э. и Карецоса Г.). В его состав входят доминирующие виды деревьев, такие как Fraxinus excelsior L. и Alnus Glutinosa (L.) Gaertn., а также Fraxinus angustifolia Vahl, Salix alba L., Populus alba L., Pinus nigra JF Arnold, Juglans regia L., Cornus sanguinea. L., Ulmus major Mill. и Quercus robur subsp. pedunculiflora (К. Кох) Меницкого. Существует множество вьющихся растений (например,Periploca graeca L. и др.), а травянистый ярус неизменно включает множество видов (например, Aegopodium podagraria L., Hedera helix L., Lysimachia punctata L., Circaea lutetiana L., Arum maculatum L. и др.) (Solomou Выборка персональных данных А. и Карецоса Г.). Дельта Нестоса образована аллювиальными отложениями реки Нестос. Речные отложения состоят из аллювиальных отложений глин, песков и гравия, тогда как пойменные отложения состоят преимущественно из глин и песков [ 23 ].

3. Результаты

3.1. Генетические результаты

Семь комбинаций праймеров AFLP дали 313 локусов для двух популяций. По результатам AFLP, восточная популяция имела полиморфизм 83,39%, а западная — 83,07%. Средняя ожидаемая гетерозиготность (He) составляла 0,127, а западная популяция имела среднюю гетерозиготность немного выше (0,136), чем восточная (0,119). Параметры генетического разнообразия представлены в Таблице 1 вместе с эпигенетическими результатами.
Таблица 1. Среднее значение и стандартная ошибка (SE) для Na (количество аллелей), Ne (количество эффективных аллелей), I (информационный индекс Шеннона) и He (ожидаемая гетерозиготность).
AMOVA (анализ молекулярной дисперсии) определил 97% генетических вариаций внутри популяций и 3% только между популяциями ( рис. 2 ). Анализ основных координат объяснил 16,89% дисперсии ( рис. 3 ).
Экология 04 00041 g002
Рисунок 2. Анализ молекулярной дисперсии среди популяций и внутри них: дисперсия среди популяций составила 3%, а внутри - 97%. Генетическая вариация фрагментов AFLP, использованных для анализа AMOVA.
Экология 04 00041 g003
Рисунок 3. Анализ основных координат объяснил 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы в зависимости от происхождения популяций. На рисунке обозначена небольшая группировка двух популяций, полученная на основе матрицы генетических расстояний генотипов.

3.2. Плотность и индекс регенерации

На четырех участках было зарегистрировано в общей сложности 233 особи A. fruticosa , в результате чего средняя плотность составила 824,07 растений на гектар. Примечательно, что плотность A. fruticosa и индекс регенерации (IR) оказались выше у популяции, проживающей на западном берегу реки, по сравнению с восточным берегом реки. Однако стоит отметить, что средняя высота деревьев была выше на восточном берегу реки, как указано в Таблице 2 . В аллювиальном лесу наиболее широко распространено возобновление чужеродных видов A. fruticosa и A. negundo (личное сообщение Коракаки).
Таблица 2. Средняя высота, средняя плотность и средний индекс регенерации (IR).

4. Дискуссия

Сообщается, что ложное индиго ( Amorpha fruticosa L.) является неместным [ 15 ], и недавние наблюдения зафиксировали его присутствие на значительных территориях вдоль рек Ардас, Эврос и Нестос на северо-востоке Греции, что указывает на его завоз из соседней Болгарии. , возможно, через речной транспорт генетического материала. В прибрежных лесах реки Нестос на северо-востоке Греции A. fruticosa демонстрирует значительную динамику регенерации и, по-видимому, подавляет растительность в важных приоритетных местообитаниях.
В этом исследовании мы оценили генетическое разнообразие двух популяций с западного и восточного берегов реки Нестос, чтобы оценить, имеют ли они различия в генетических параметрах или имеют ли они схожие индексы генетического разнообразия. По оценкам локусов AFLP, гетерозиготность западной популяции была немного выше, но существенно не отличалась от восточной популяции. Более того, как показал анализ AMOVA, большая часть генетических вариаций наблюдалась внутри популяций (97%). Анализ основных координат объяснил лишь 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы по происхождению популяций. Главный вывод генетического анализа заключался в том, что западные и восточные популяции имеют общий генетический фонд, который поступает с водой через реку Нестос.
Что касается аналогичных исследований, авторы не обнаружили никаких упоминаний о генетическом разнообразии с использованием молекулярных маркеров растений A. fruticosa . Однако есть одно исследование [ 24 ], в котором они измерили 47 агрономических и морфологических признаков энергии биомассы. Результаты показали, что на все признаки повлияли образцы, и это ключ, который также может демонстрировать генетическое содержание, которое, вероятно, влияет на изменчивость. Кроме того, были проведены исследования экспрессии генов, связанных с засухой [ 25 ], фенольных компонентов [ 26 ], протеомного анализа симбиотических белков [ 27 ] и исследований рака [ 28 , 29] .]. Вышеупомянутые исследования с одной точки зрения указывают на значение A. fruticosa , хотя мы не можем исключить негативное воздействие, которое он оказывает на экосистемы из-за его быстрого распространения. Этот инвазивный вид может проникнуть в луговые сообщества и быстро превратить среду обитания в густые и однородные заросли. Он вытесняет местные растения и нарушает естественную сукцессию растений и биоразнообразие. Это представляет собой серьезную угрозу, поскольку подавляет местные виды деревьев в приоритетном аллювиальном лесу дельты Нестоса (91E0*). Кроме того, это ставит под угрозу выживание видов Emys orbcularis , Testudo Hermanni и Callimorpha Quadripunctaria *, поскольку они зависят от этих мест обитания.
Согласно нашим выводам, A. fruticosa более активно развивается на западном берегу реки Нестос, что представляет значительный риск для биоразнообразия и подавления местных видов деревьев в аллювиальных лесах региона Нестос. Таким образом, любые природоохранные меры и действия по управлению лесами, направленные на ограничение распространения A. fruticosa , должны быть приоритетными на этом берегу реки. Меры по сохранению необходимы для защиты и поддержания этой естественной среды обитания, которая представляет значительный интерес для сообщества. Действия также должны быть направлены на повышение осведомленности об угрозах, с которыми сталкиваются аллювиальные леса, и на обеспечение их долгосрочной защиты и сохранения. Этот результат ИК дает нам первое указание на то, что A. fruticosaбудет более обширным на западной стороне, и результат небольшой, но более высокой гетерозиготности согласуется с текущим результатом. С 2021 года Институт средиземноморских лесных экосистем (ELGO-DIMITRA) разрабатывает различные экспериментальные методы лечения, чтобы изучить возможные решения по ограничению распространения A. fruticosa .
Наконец, в этом исследовании мы обнаружили аналогичный генетический пул с восточного и западного берегов реки Нестос, который, вероятно, происходит из Болгарии. Будущие исследования должны также включать генетический анализ этих болгарских популяций. Считается необходимым продолжить исследования и изучение A. fruticosa в ближайшие годы, чтобы было более полное знание этого вида и его влияния на экосистему, чтобы затем можно было создать и создать систему управления этим видом. его преимущества можно использовать, не оказывая негативного воздействия на экосистему.

5. Выводы

Первое сообщение о генетическом разнообразии и распространении чужеродного вида Amorpha fruticosa L. было впервые использовано за рекой Нестос в Греции. Мы изучили две популяции, одну с западной стороны и одну с восточной стороны, с маркерами AFLP, и не обнаружили дифференциации между ними. Это указывает на то, что, вероятно, один генетический пул был передан через реку из Болгарии, и будущие исследования должны также охватывать болгарские популяции. Кроме того, проведенная первая оценка состояния регенерации также указывает на расширение вида. Это обязательный шаг для оценки и предложения мер управления с целью сохранения и ограничения распространения вида, который оказывает существенное негативное воздействие на среду обитания 91E0*.

Вклад автора

Концептуализация, EVA и EK; методология, EVA, EK, EM, ADS, GM и ГК; программное обеспечение, EVA, EM и EK; проверка, все; ресурсы, EVA и EK; курирование данных, EVA и EK; письмо — подготовка оригинального проекта, EVA, EK, EM и ADS; написание — просмотр и редактирование, все; надзор, EVA и EK; администрация проекта, ЭК; приобретение финансирования, Е.К. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Это исследование финансировалось проектом LIFE PRIMED, LIFE17 NAT/GR/000511, который софинансируется Греческим зеленым фондом (GRFU).

Заявление о доступности данных

Данные недоступны.

Конфликт интересов

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Рекомендации

  1. Ричардсон, DM; Пышек, П.; Рейманек, М.; Барбур, Миннесота; Панетта, Флорида; Уэст, К.Дж. Натурализация и вторжение чужеродных растений: концепции и определения. Дайверы. Распредел. 2000 , 6 , 93–107. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  2. Коракаки, ​​Э.; Легакис, А.; Кацаневакис, С.; Кулелис, П.; Аврамиду, Э.; Сулиоти, Н.; Петракис, П. Инвазивные чужеродные виды Греции. Обсервация инвазивных чужеродных видов. Проблемы вокруг света 2021 , 3 , 124–189. [ Академика Google ]
  3. Мияваки, С.; Вашитани, И. Инвазивные чужеродные виды растений в прибрежных районах Японии: вклад сельскохозяйственных сорняков, видов восстановления растительности и аквакультурных видов. Глоб. Окружающая среда. Рез.-англ. Эд. 2004 , 8 , 89–101. [ Академика Google ]
  4. Каллауэй, РМ; Ашехуг, Э.Т. Инвазивные растения против их новых и старых соседей: механизм экзотического вторжения. Наука 2000 , 290 , 521–523. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  5. Иванеску, Б.; Лунгу, К.; Власе, Л.; Градинару, AC; Тухилус, К. ВЭЖХ-анализ фенольных соединений, антиоксидантной и противомикробной активности Amorpha fruticosa L. Экстракты. Дж. Плант Дев. 2019 , 26 , 77. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  6. Штрауб, Южная Каролина; Извините, бакалавр; Уикли, А.С. Amorpha confusa , новое название старой Amorpha (Fabaceae: Amorpheae). Дж. Бот. Рез. Инст. Техас, 2009 г. , 151–155. [ Академика Google ]
  7. Штрауб, Южная Каролина; Дойл, Дж. Дж. Молекулярная филогенетика Amorpha (Fabaceae): оценка монофилии, видовых отношений и полиплоидного происхождения. Мол. Филогенетика Эвол. 2014 , 76 , 49–66. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  8. Лю, Дж.; Ван, ET; Chen, WX Разнообразные ризобии, связанные с древесными бобовыми культурами Wisteria sinensis , Cercis Racemosa и Amorpha fruticosa, выращиваемыми в умеренной зоне Китая. Сист. Прил. Микробиол. 2005 , 28 , 465–477. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  9. Китайский, П. Словарь китайской Materia Medica ; Китайская научно-техническая медицинская пресса: Пекин, Китай, 1997. [ Google Scholar ]
  10. Митчер, Луизиана; Парк, Ю.Х.; Альшамма, А.; Хадсон, ПБ; Хаас, Т. Аморфрутин a и b, бибензиловые противомикробные средства из Amorpha fruticosa . Фитохимия 1981 , 20 , 781–785. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  11. Крпан, АП; Томашич, Ж.; Башич Палкович, П. Биопотенциал индигобуша ( Amorpha fruticosa L.) – второй год исследования. Список Шумарского. 2011 , 135 , 103–112. [ Академика Google ]
  12. Кожухарова Е.; Матковский, А.; Возняк, Д.; Симеонова Р.; Найчов З.; Малайнер, К.; Мокан, А.; Набави, С.М.; Атанасов А.Г. Amorpha fruticosa – вредоносное инвазионное чужеродное растение в Европе или лекарственное растение от болезней обмена веществ? Передний. Фармакол. 2017 , 8 , 333. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  13. Сигетвари, К. Первые шаги по восстановлению пойменного луга после десятилетия доминирования инвазивного кустарника-трансформера Amorpha fruticosa L. Tiscia 2002 , 33 , 67–77. [ Академика Google ]
  14. Педашенко, Л.П.; Апостолова, И.И.; Васильев К.В. Невселенность Amorpha fruticosa в различных местообитаниях нижнего Дуная. Фитол. Балк. 2012 , 18 , 285–291. [ Академика Google ]
  15. Ариануцу, М.; Базос, И.; Делипетру, П.; Коккорис, Ю. Инопланетная флора Греции: таксономия, особенности жизни и предпочтения среды обитания. Биол. Вторжения 2010 , 12 , 3525–3549. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  16. Самарас, АГ; Коутитас, К.Г. Моделирование воздействия на прибрежную морфологию управления водными ресурсами в трансграничных речных бассейнах: пример реки Нестос. Менеджер. Окружающая среда. Квал. Межд. Дж. 2008 , 19 , 455–466. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  17. Декамп, Х.; Декамп, О. Средиземноморские прибрежные леса ; Сохранение водно-болотных угодий Средиземноморья; Тур дю Валат: Арль, Франция, 2001 г. [ Google Scholar ]
  18. Маллинис, Г.; Эмманолудис, Д.; Яннакопулос, В.; Марис, Ф.; Куциас, Н. Картирование и интерпретация исторических изменений растительного покрова/землепользования на участке «Натура 2000» с использованием данных наблюдений за Землей: пример дельты Нестоса, Греция. Прил. геогр. 2011 , 31 , 312–320. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  19. Дафис, С.; Папастергиаду, Э.; Георгиу, К.; Бабалонас, Д.; Георгиадис, Т.; Папагеоргиу, М.; Лазариду, Т.; Циаусси, В. Греческий проект «среды обитания» Natura 2000: Обзор. Пожизненный контракт B4-32000/94/756 ; Комиссия Европейских Сообществ, Музей естественной истории Гуландриса, Центр греческих биотопов и водно-болотных угодий; Springer: Берлин/Гейдельберг, Германия, 1996. [ Google Scholar ]
  20. Бьянки, Л.; Пачи, М. Эволюционная динамика и тосканское обучение: Sintesi di quarant'anni di richerche. Для.-Ж. Сильвик. Для. Экол. 2008 , 5 , 122. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
  21. Векеманс, X.; Боуэнс, Т.; Лемэр, М.; Ролдан-Руис, И. Данные маркеров амплифицированного полиморфизма длин фрагментов (AFLP) указывают на гомоплазию по размеру и взаимосвязь между степенью гомоплазии и размером фрагмента. Мол. Экол. 2002 , 11 , 139–151. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  22. Пикалл, РОД; Смаус, ЧП Genalex 6: Генетический анализ в Excel. Программное обеспечение популяционной генетики для обучения и исследований. Мол. Экол. Примечания 2006 , 6 , 288–295. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  23. Тафтсоглу, М.; Валканиотис, С.; Папатанасиу, Г.; Климис, Н.; Докас, И. Подробная карта подверженности разжижению дельты реки Нестос, Фракия, Греция, основанная на поверхностной геологии и геоморфологии. Geosciences 2022 , 12 , 361. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  24. ДеХаан, Л.; Эльке, Н.; Шиффер, К.; Вайз, Д.; ДеХаан, Р. Оценка разнообразия североамериканских образцов ложного индиго ( Amorpha fruticosa L.) для корма и биомассы. Жене. Ресурс. Кроп Эвол. 2006 , 53 , 1463–1476. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  25. Ли, М.; Лю, З.; Лю, К.; Чжу, Ф.; Ван, К.; Ван, З.; Ли, Х.; Лан, X.; Гуан, К. Засухоустойчивость табака, сверхэкспрессирующего ген afnac1 Amorpha fruticosa Linn. Передний. Наука о растениях. 2022 , 13 , 980171. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  26. Дат, Северная Каролина; Ли, Дж.-Х.; Лук-порей.; Хонг, Ю.-С.; Ким, Ю.Х.; Ли, Дж. Дж. Фенольные компоненты Amorpha fruticosa , которые ингибируют активацию nf-κb и связанную с ней экспрессию генов. Дж. Нэт. Прод. 2008 , 71 , 1696–1700. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  27. Песня, Ф.; Ци, Д.; Лю, X.; Конг, X.; Гао, Ю.; Чжоу, З.; Ву, К. Протеомный анализ симбиотических белков Glomus mosseae и Amorpha fruticosa . наук. Rep. 2015 , 5 , 18031. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  28. Тодорова Т.; Бояджиев, К.; Шкондров А.; Пырванова П.; Димитрова, М.; Ионкова И.; Крастева И.; Кожухарова Е.; Чанкова, С. Скрининг экстрактов Amorpha fruticosa и Ailanthus altissima на генотоксичность/антигенотоксичность, мутагенность/антимутагенность и канцерогенность/антиканцерогенность. БиоРиск 2022 , 17 , 201–212. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  29. Цветкович, Д.М.; Йованкич, СП; Милутинович, М.Г.; Никодиевич, Д.Д.; Грбович, Ф.Дж.; Чирич, АР; Топузович, доктор медицинских наук; Маркович, С.Д. Противоинвазивная активность Robinia pseudoacacia L. и Amorpha fruticosa L. На клеточной линии рака молочной железы mda-mb-231. Биология 2019 , 74 , 915–928. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
Чужеродные и инвазивные растения угрожают целостности природных экосистем, поскольку большинство из них являются инвазивными, конкурируют с местными растениями и во многих случаях занимают их место в экосистеме. Инвазивные виды характеризуются быстрым распространением за счет производства большого количества потомства, которое может рассеиваться на большие расстояния [ 1 ]. Более того, они имеют высокую выживаемость благодаря своей пластичности, способной реагировать на различные условия окружающей среды. Кроме того, некоторые природные явления могут способствовать их распространению, например, наводнения, ветер, поверхностная эрозия и т. д.
На распространение инвазивных видов также существенно повлияла деятельность человека [ 2 ]. С древних времен чужеродные растения случайно или намеренно переносились в новые места обитания и культивировались как садовые или декоративные растения [ 3 ]. Их распространению способствует также деятельность человека, роль которой двоякая: транспортировка размножающегося материала и изменение среды обитания. Главное преимущество заключается в том, что у них нет физических врагов, которые бы контролировали их население, чтобы они в полной мере использовали свой конкурентный потенциал. Некоторые инвазивные растения также развивают новые механизмы взаимодействия с природными экосистемами [ 4 ]. Одним из таких механизмов является продукция аллелопатических веществ и их выброс в экосистему [ 5].
Amorpha L. ( Fabaceae Juss.: Amorpheae Britains .) — род из 16 видов, произрастающих в Северной Америке [ 6 ]. Эти растения могут представлять собой кустарники, полукустарники или травянистые многолетние растения и встречаются в различных средах обитания, включая прибрежные коридоры, саванны и луга. Многие виды Amorpha имеют очень ограниченное распространение, а некоторые считаются находящимися под угрозой исчезновения [ 7 ].
Amorpha fruticosa L. (куст индиго) — многолетний листопадный кустарник, принадлежащий к семейству Fabaceae и произрастающий в юго-западной части Северной Америки [ 8 ]. Куст индиго был завезен в Европу как декоративное растение [ 5 ]. Его используют как лекарство для лечения ожогов и экземы [ 9 ]. В последние годы ему уделяется особое внимание из-за его биологической активности. Исследования показали, что это растение богато полифенолами и содержит биологически активные ингредиенты. Он также обладает противораковой, противовоспалительной и противомикробной активностью [ 10] .]. Куст индиго – растение, имеющее большую декоративную ценность и используемое при обустройстве городских ландшафтов и при охране склонов. Он может выжить в сухих почвах, но предпочитает берега рек и опушки затопленных лесов, где легко распространяется водой, поскольку его семенные коробочки плавучие [11 ] . Его высокая толерантность к различным климатическим условиям, а также отличная способность к размножению дают ему возможность с легкостью расти за пределами своего естественного распространения [ 12 ]. Сегодня он признан одним из наиболее инвазивных видов в Европе, оказывающим серьезное воздействие на местные экосистемы [ 11 ]. Это светолюбивое растение, конкурирующее за свет, образующее густые заросли, затмевающие местную флору, а это приводит к снижению биоразнообразия [ 11, 12 , 13 ]. Из-за ущерба, который он наносит природным экосистемам и водному хозяйству, следует немедленно принять меры по сокращению/контролю его популяции.
В Греции трансграничные реки, такие как Нестос, Аксиос и др., являются транспортными коридорами для чужеродных видов растений, которые расширяют свой ареал за счет воды [ 14 ]. Однако, помимо конкретного вида транспорта, в последние годы в Грецию были интродуцированы многие зарубежные виды растений, как намеренно (например, декоративные и лекарственные растения), так и непреднамеренно, используя различные способы интродукции [2 ] . Хотя число чужеродных видов велико, не все из них являются инвазивными. Из 343 чужеродных видов только 50 проявляют инвазионное поведение, и большинство из них имеют американское происхождение [ 15 ].
Нестос — трансграничная река Болгарии и Северной Греции. Берет начало от горы Рила на юге Болгарии и проходит между горными хребтами Аймос и Родопы. Его длина составляет 234 км, из них 130 км находится на территории Греции [ 16 ]. Прежде чем впасть в море, он простирается через равнину Хрисуполис и расширяется как дельтовая система с пресноводными озерами, образующими дельту Нестоса. В этой зоне существует приоритетная среда обитания 91E0 (Приложение I Директивы 92/43/EEC), в которой представлены два подтипа: подтип ольховых насаждений ( Alnus Glutinosa ) и подтип тополя белого ( Populus alba ) и вяза ( Ulmusminor ).) стоит. Первый подтип состоит из чистых насаждений ольхи, произрастающих на легких и умеренно легких почвах с очень хорошими физическими свойствами, которые можно охарактеризовать как Calcaric fluvisols. При этом уровень грунтовых вод относительно высокий (90–95 см). Этот подтип встречается между дамбами, местами вблизи берегов рек или в местах, удаленных от них на несколько десятков метров. Второй подтип составляет значительную часть тугайного леса и располагается за пределами дамб. Он состоит из насаждений белого тополя и вяза, которые растут на глубоких и умеренно легких почвах с хорошими физическими свойствами, принадлежащих к типу почв Eutric Fluvisol, без проблем с щелочностью и засоленностью. Уровень грунтовых вод низкий, но сильно колеблется [ 17 ].
Территория вдоль реки существенно изменилась со времен Второй мировой войны [ 18 ]. В 1945 году на этой территории преобладали леса и водно-болотные угодья. В 1960-е годы площадь сельскохозяйственных угодий увеличилась, что привело к уменьшению лесных площадей. Также произошло значительное сокращение площади водно-болотных угодий из-за их преобразования в пастбища. Однако, несмотря на сильное упадок природной экосистемы, в этом районе по-прежнему сохраняется самый обширный речной лес в Греции. Кроме того, равнина реки Нестос имеет важное экологическое значение из-за множества важных мест обитания. Он был классифицирован как водно-болотное угодье международного значения и включен в Рамсарскую конвенцию. Он также защищен Бернской конвенцией, директивами Европейской комиссии и законодательством Греции. Кроме того, он принадлежит к сети Natura 2000.19 ].
В Греции Amorpha fruticosa L. считается инвазивным видом, поскольку это растение способно распространяться на обширной территории. В настоящей работе изучено генетическое разнообразие популяций Amorpha fruticosa L., произрастающих вдоль реки Нестос. Наши цели заключались в том, чтобы (1) определить уровень генетической дифференциации, если она существует, между двумя берегами реки: западным и восточным; (2) оценить степень инбридинга в каждой популяции, а также эффективный размер популяции; и (3) обсудить последствия расширения конкретных видов в естественной экосистеме и, более конкретно, в популяциях местных видов в этом районе.

2. Материалы и методы

2.1. Растительный материал

Сбор образцов листьев проведен на 20 особях Amorpha fruticosa из 2 популяций района реки Нестос (ориентировочные координаты западной популяции A: X: 565671, Y: 4527927 и восточной популяции: X: 566918, Y: 4525481). Экстракцию ДНК из свежей хвои проводили с помощью набора Macherey Nagel Plant (Düren, Северный Рейн-Вестфалия, Германия) в соответствии с протоколом производителя.

2.2. Процедура ПФЛП

Всего 200 нг геномной ДНК фрагментировали расщеплением 4 ед. ферментов EcoRI и MseI при температуре 37°С в течение 3 часов. Расщепленные фрагменты ДНК затем объединяли с адаптерами EcoRI и MseI и полученную смесь лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 от New England Biolabs (Ипсвич, Массачусетс, США). Этот этап лигирования проводили при температуре 26°C в течение 3 часов. Полученную в результате этого процесса ДНК использовали в качестве первичной матрицы для анализа AFLP.
Для этапа преамплификации использовали пару праймеров на основе последовательностей адаптеров EcoRI и MseI с дополнительным селективным нуклеотидом на 3'-конце (EcoRI+A и MseI+C). ПЦР с предварительной амплификацией проводили в общем объеме 20 мкл, который содержал 1X буфер Kapa Taq, 0,2 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl 2., 30 нг каждого праймера (EcoRI+A и MseI+C), 1 единица ДНК-полимеразы Taq от Kapa Biosystems (расположена в Уилмингтоне, Массачусетс, США) и 5 ​​мкл разведенных фрагментов ДНК, полученных в результате реакции расщепления и лигирования. . Условия циклирования ПЦР были следующими: начальная денатурация при 95 °С в течение 30 с, затем 32 цикла денатурации при 95 °С в течение 30 с, отжиг при 56 °С в течение 30 с, удлинение при 72 °С в течение 1 мин. и заключительный этап удлинения при 72 ° C в течение 10 минут. Для подтверждения амплификации образец реакции объемом 5 мкл подвергали электрофорезу в агарозном геле, а оставшиеся 15 мкл разбавляли в 5 раз ТЕ-буфером.
Селективную амплификацию проводили в реакционных объемах объемом 10 мкл, состоящих из 3 мкл разбавленной преселективной матрицы, и с использованием тех же условий реакции, что и на стадии преселективной амплификации, за исключением использования 30 нг праймера MseI и 5 нг праймера EcoRI. за реакцию. Программа циклической селективной амплификации осуществлялась с использованием термоциклера BioRad (Hercules, Калифорния, США) по следующей схеме: начальный цикл денатурации при 95 °C в течение 30 с, отжиг при 65 °C в течение 30 с и удлинение при 95 °C в течение 30 с. 72 °С в течение 1 мин. За этим следовали двенадцать циклов денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг, начинающийся при 65°С в течение 30 с и уменьшающийся на 0,75°С в каждом цикле, и удлинение при 72°С в течение 1 мин. Наконец, двадцать три цикла денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг при 56°С в течение 30 с,
Смеси продуктов f-AFLP подвергали денатурации путем обработки их формамидом при температуре 94 °С в течение 2 мин. Впоследствии эти денатурированные смеси разделяли электрофорезом с использованием генетического анализатора ABI Prism 3730xl, который производится Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Использовали десять комбинаций селективных праймеров AFLP. Затем каждый отдельный гибрид исследовали для определения наличия или отсутствия конкретных фрагментов. Размер обнаруженных фрагментов определяли с использованием программы GeneMapper 4.0 вместе с внутренним стандартом, известным как GS 500 LIZ, который также был предоставлен Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров,20 ].

2.3. Индекс регенерации

Присутствие и плотность A. fruticosa оценивались в приоритетном местообитании 91E0* в районе Нестос на северо-востоке Греции ( рис. 1 ). Пятнадцать (15) участков, каждый площадью 706,86 м 2 , были выбраны случайным образом и равномерно размещены по всей территории обитания 91E0*. В дальнейшем был проведен анализ состава и структуры древесных пород на этих участках. A. fruticosa присутствовала на четырех участках из 15, из которых три располагались на западном берегу реки и один на восточном. У особей A. fruticosa измеряли высоту дерева (м), плотность (особей га -1 ) и индекс регенерации (IR) . IR рассчитывали путем умножения плотности A. fruticosa (на м2 ) по средней высоте A. fruticosa (см) и позволяет оценить степень регенерации [ 20 ].
Экология 04 00041 g001
Рисунок 1. Amorpha fruticosa , распространенная на приоритетном местообитании 91Ε0* в дельте Нестоса, на северо-востоке Греции.

2.4. Сбор данных и статистический анализ данных AFLP

Для преобразования информации о размере аллелей, полученной с помощью GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems, США), в двоичный формат использовался макрос AFLP Excel. Этот макрос присваивал значение «1» присутствующим фрагментам и «0» отсутствующим. Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров, подсчитывали и подвергали дополнительному изучению только согласованные фрагменты, попадающие в диапазон от 150 до 500 пар оснований [ 21 ]. Кроме того, GenAlex v6.0 [ 22 ] использовался для расчета таких параметров, как процент полиморфных полос (P), информационный индекс Шеннона (I) и генетическое разнообразие (He). GenAlex v6.0 также использовался для проведения анализа молекулярной дисперсии (AMOVA), а также для расчета генетических расстояний и анализа главных координат (PCoA).
Подробно, анализ главных координат (PCoA) представляет собой многомерный метод, который позволяет находить и отображать основные закономерности в многомерном наборе данных (например, множественных локусах и множественных образцах). Математика сложна, но, по сути, PCoA — это процесс, с помощью которого основные оси вариаций располагаются в многомерном наборе данных. Для многомерных наборов данных каждая последующая ось объясняет пропорционально меньшую часть общей вариации, так что при наличии отдельных групп первые две или три оси обычно выявляют большую часть разделения между ними. Предусмотрено четыре различных варианта: два основаны на преобразовании матрицы расстояний в ковариационную матрицу, а два работают непосредственно на основе входной матрицы расстояний. Матрица расстояний используется как пул для расчета распределения по осям [22 ].

2.5. Информация о среде обитания 91E0*

Местообитание 91E0* в дельте реки Нестос простирается на небольших высотах (<100 м над уровнем моря) с поверхностями от умеренного до плоского рельефа (уклон 0–10%) (выборка личных данных Коракаки Э. и Карецоса Г.). В его состав входят доминирующие виды деревьев, такие как Fraxinus excelsior L. и Alnus Glutinosa (L.) Gaertn., а также Fraxinus angustifolia Vahl, Salix alba L., Populus alba L., Pinus nigra JF Arnold, Juglans regia L., Cornus sanguinea. L., Ulmus major Mill. и Quercus robur subsp. pedunculiflora (К. Кох) Меницкого. Существует множество вьющихся растений (например,Periploca graeca L. и др.), а травянистый ярус неизменно включает множество видов (например, Aegopodium podagraria L., Hedera helix L., Lysimachia punctata L., Circaea lutetiana L., Arum maculatum L. и др.) (Solomou Выборка персональных данных А. и Карецоса Г.). Дельта Нестоса образована аллювиальными отложениями реки Нестос. Речные отложения состоят из аллювиальных отложений глин, песков и гравия, тогда как пойменные отложения состоят преимущественно из глин и песков [ 23 ].

3. Результаты

3.1. Генетические результаты

Семь комбинаций праймеров AFLP дали 313 локусов для двух популяций. По результатам AFLP, восточная популяция имела полиморфизм 83,39%, а западная — 83,07%. Средняя ожидаемая гетерозиготность (He) составляла 0,127, а западная популяция имела среднюю гетерозиготность немного выше (0,136), чем восточная (0,119). Параметры генетического разнообразия представлены в Таблице 1 вместе с эпигенетическими результатами.
Таблица 1. Среднее значение и стандартная ошибка (SE) для Na (количество аллелей), Ne (количество эффективных аллелей), I (информационный индекс Шеннона) и He (ожидаемая гетерозиготность).
AMOVA (анализ молекулярной дисперсии) определил 97% генетических вариаций внутри популяций и 3% только между популяциями ( рис. 2 ). Анализ основных координат объяснил 16,89% дисперсии ( рис. 3 ).
Экология 04 00041 g002
Рисунок 2. Анализ молекулярной дисперсии среди популяций и внутри них: дисперсия среди популяций составила 3%, а внутри - 97%. Генетическая вариация фрагментов AFLP, использованных для анализа AMOVA.
Экология 04 00041 g003
Рисунок 3. Анализ основных координат объяснил 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы в зависимости от происхождения популяций. На рисунке обозначена небольшая группировка двух популяций, полученная на основе матрицы генетических расстояний генотипов.

3.2. Плотность и индекс регенерации

На четырех участках было зарегистрировано в общей сложности 233 особи A. fruticosa , в результате чего средняя плотность составила 824,07 растений на гектар. Примечательно, что плотность A. fruticosa и индекс регенерации (IR) оказались выше у популяции, проживающей на западном берегу реки, по сравнению с восточным берегом реки. Однако стоит отметить, что средняя высота деревьев была выше на восточном берегу реки, как указано в Таблице 2 . В аллювиальном лесу наиболее широко распространено возобновление чужеродных видов A. fruticosa и A. negundo (личное сообщение Коракаки).
Таблица 2. Средняя высота, средняя плотность и средний индекс регенерации (IR).

4. Дискуссия

Сообщается, что ложное индиго ( Amorpha fruticosa L.) является неместным [ 15 ], и недавние наблюдения зафиксировали его присутствие на значительных территориях вдоль рек Ардас, Эврос и Нестос на северо-востоке Греции, что указывает на его завоз из соседней Болгарии. , возможно, через речной транспорт генетического материала. В прибрежных лесах реки Нестос на северо-востоке Греции A. fruticosa демонстрирует значительную динамику регенерации и, по-видимому, подавляет растительность в важных приоритетных местообитаниях.
В этом исследовании мы оценили генетическое разнообразие двух популяций с западного и восточного берегов реки Нестос, чтобы оценить, имеют ли они различия в генетических параметрах или имеют ли они схожие индексы генетического разнообразия. По оценкам локусов AFLP, гетерозиготность западной популяции была немного выше, но существенно не отличалась от восточной популяции. Более того, как показал анализ AMOVA, большая часть генетических вариаций наблюдалась внутри популяций (97%). Анализ основных координат объяснил лишь 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы по происхождению популяций. Главный вывод генетического анализа заключался в том, что западные и восточные популяции имеют общий генетический фонд, который поступает с водой через реку Нестос.
Что касается аналогичных исследований, авторы не обнаружили никаких упоминаний о генетическом разнообразии с использованием молекулярных маркеров растений A. fruticosa . Однако есть одно исследование [ 24 ], в котором они измерили 47 агрономических и морфологических признаков энергии биомассы. Результаты показали, что на все признаки повлияли образцы, и это ключ, который также может демонстрировать генетическое содержание, которое, вероятно, влияет на изменчивость. Кроме того, были проведены исследования экспрессии генов, связанных с засухой [ 25 ], фенольных компонентов [ 26 ], протеомного анализа симбиотических белков [ 27 ] и исследований рака [ 28 , 29] .]. Вышеупомянутые исследования с одной точки зрения указывают на значение A. fruticosa , хотя мы не можем исключить негативное воздействие, которое он оказывает на экосистемы из-за его быстрого распространения. Этот инвазивный вид может проникнуть в луговые сообщества и быстро превратить среду обитания в густые и однородные заросли. Он вытесняет местные растения и нарушает естественную сукцессию растений и биоразнообразие. Это представляет собой серьезную угрозу, поскольку подавляет местные виды деревьев в приоритетном аллювиальном лесу дельты Нестоса (91E0*). Кроме того, это ставит под угрозу выживание видов Emys orbcularis , Testudo Hermanni и Callimorpha Quadripunctaria *, поскольку они зависят от этих мест обитания.
Согласно нашим выводам, A. fruticosa более активно развивается на западном берегу реки Нестос, что представляет значительный риск для биоразнообразия и подавления местных видов деревьев в аллювиальных лесах региона Нестос. Таким образом, любые природоохранные меры и действия по управлению лесами, направленные на ограничение распространения A. fruticosa , должны быть приоритетными на этом берегу реки. Меры по сохранению необходимы для защиты и поддержания этой естественной среды обитания, которая представляет значительный интерес для сообщества. Действия также должны быть направлены на повышение осведомленности об угрозах, с которыми сталкиваются аллювиальные леса, и на обеспечение их долгосрочной защиты и сохранения. Этот результат ИК дает нам первое указание на то, что A. fruticosaбудет более обширным на западной стороне, и результат небольшой, но более высокой гетерозиготности согласуется с текущим результатом. С 2021 года Институт средиземноморских лесных экосистем (ELGO-DIMITRA) разрабатывает различные экспериментальные методы лечения, чтобы изучить возможные решения по ограничению распространения A. fruticosa .
Наконец, в этом исследовании мы обнаружили аналогичный генетический пул с восточного и западного берегов реки Нестос, который, вероятно, происходит из Болгарии. Будущие исследования должны также включать генетический анализ этих болгарских популяций. Считается необходимым продолжить исследования и изучение A. fruticosa в ближайшие годы, чтобы было более полное знание этого вида и его влияния на экосистему, чтобы затем можно было создать и создать систему управления этим видом. его преимущества можно использовать, не оказывая негативного воздействия на экосистему.

5. Выводы

Первое сообщение о генетическом разнообразии и распространении чужеродного вида Amorpha fruticosa L. было впервые использовано за рекой Нестос в Греции. Мы изучили две популяции, одну с западной стороны и одну с восточной стороны, с маркерами AFLP, и не обнаружили дифференциации между ними. Это указывает на то, что, вероятно, один генетический пул был передан через реку из Болгарии, и будущие исследования должны также охватывать болгарские популяции. Кроме того, проведенная первая оценка состояния регенерации также указывает на расширение вида. Это обязательный шаг для оценки и предложения мер управления с целью сохранения и ограничения распространения вида, который оказывает существенное негативное воздействие на среду обитания 91E0*.

Вклад автора

Концептуализация, EVA и EK; методология, EVA, EK, EM, ADS, GM и ГК; программное обеспечение, EVA, EM и EK; проверка, все; ресурсы, EVA и EK; курирование данных, EVA и EK; письмо — подготовка оригинального проекта, EVA, EK, EM и ADS; написание — просмотр и редактирование, все; надзор, EVA и EK; администрация проекта, ЭК; приобретение финансирования, Е.К. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Это исследование финансировалось проектом LIFE PRIMED, LIFE17 NAT/GR/000511, который софинансируется Греческим зеленым фондом (GRFU).

Заявление о доступности данных

Данные недоступны.

Конфликт интересов

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Рекомендации

  1. Ричардсон, DM; Пышек, П.; Рейманек, М.; Барбур, Миннесота; Панетта, Флорида; Уэст, К.Дж. Натурализация и вторжение чужеродных растений: концепции и определения. Дайверы. Распредел. 2000 , 6 , 93–107. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  2. Коракаки, ​​Э.; Легакис, А.; Кацаневакис, С.; Кулелис, П.; Аврамиду, Э.; Сулиоти, Н.; Петракис, П. Инвазивные чужеродные виды Греции. Обсервация инвазивных чужеродных видов. Проблемы вокруг света 2021 , 3 , 124–189. [ Академика Google ]
  3. Мияваки, С.; Вашитани, И. Инвазивные чужеродные виды растений в прибрежных районах Японии: вклад сельскохозяйственных сорняков, видов восстановления растительности и аквакультурных видов. Глоб. Окружающая среда. Рез.-англ. Эд. 2004 , 8 , 89–101. [ Академика Google ]
  4. Каллауэй, РМ; Ашехуг, Э.Т. Инвазивные растения против их новых и старых соседей: механизм экзотического вторжения. Наука 2000 , 290 , 521–523. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  5. Иванеску, Б.; Лунгу, К.; Власе, Л.; Градинару, AC; Тухилус, К. ВЭЖХ-анализ фенольных соединений, антиоксидантной и противомикробной активности Amorpha fruticosa L. Экстракты. Дж. Плант Дев. 2019 , 26 , 77. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  6. Штрауб, Южная Каролина; Извините, бакалавр; Уикли, А.С. Amorpha confusa , новое название старой Amorpha (Fabaceae: Amorpheae). Дж. Бот. Рез. Инст. Техас, 2009 г. , 151–155. [ Академика Google ]
  7. Штрауб, Южная Каролина; Дойл, Дж. Дж. Молекулярная филогенетика Amorpha (Fabaceae): оценка монофилии, видовых отношений и полиплоидного происхождения. Мол. Филогенетика Эвол. 2014 , 76 , 49–66. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  8. Лю, Дж.; Ван, ET; Chen, WX Разнообразные ризобии, связанные с древесными бобовыми культурами Wisteria sinensis , Cercis Racemosa и Amorpha fruticosa, выращиваемыми в умеренной зоне Китая. Сист. Прил. Микробиол. 2005 , 28 , 465–477. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  9. Китайский, П. Словарь китайской Materia Medica ; Китайская научно-техническая медицинская пресса: Пекин, Китай, 1997. [ Google Scholar ]
  10. Митчер, Луизиана; Парк, Ю.Х.; Альшамма, А.; Хадсон, ПБ; Хаас, Т. Аморфрутин a и b, бибензиловые противомикробные средства из Amorpha fruticosa . Фитохимия 1981 , 20 , 781–785. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  11. Крпан, АП; Томашич, Ж.; Башич Палкович, П. Биопотенциал индигобуша ( Amorpha fruticosa L.) – второй год исследования. Список Шумарского. 2011 , 135 , 103–112. [ Академика Google ]
  12. Кожухарова Е.; Матковский, А.; Возняк, Д.; Симеонова Р.; Найчов З.; Малайнер, К.; Мокан, А.; Набави, С.М.; Атанасов А.Г. Amorpha fruticosa – вредоносное инвазионное чужеродное растение в Европе или лекарственное растение от болезней обмена веществ? Передний. Фармакол. 2017 , 8 , 333. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  13. Сигетвари, К. Первые шаги по восстановлению пойменного луга после десятилетия доминирования инвазивного кустарника-трансформера Amorpha fruticosa L. Tiscia 2002 , 33 , 67–77. [ Академика Google ]
  14. Педашенко, Л.П.; Апостолова, И.И.; Васильев К.В. Невселенность Amorpha fruticosa в различных местообитаниях нижнего Дуная. Фитол. Балк. 2012 , 18 , 285–291. [ Академика Google ]
  15. Ариануцу, М.; Базос, И.; Делипетру, П.; Коккорис, Ю. Инопланетная флора Греции: таксономия, особенности жизни и предпочтения среды обитания. Биол. Вторжения 2010 , 12 , 3525–3549. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  16. Самарас, АГ; Коутитас, К.Г. Моделирование воздействия на прибрежную морфологию управления водными ресурсами в трансграничных речных бассейнах: пример реки Нестос. Менеджер. Окружающая среда. Квал. Межд. Дж. 2008 , 19 , 455–466. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  17. Декамп, Х.; Декамп, О. Средиземноморские прибрежные леса ; Сохранение водно-болотных угодий Средиземноморья; Тур дю Валат: Арль, Франция, 2001 г. [ Google Scholar ]
  18. Маллинис, Г.; Эмманолудис, Д.; Яннакопулос, В.; Марис, Ф.; Куциас, Н. Картирование и интерпретация исторических изменений растительного покрова/землепользования на участке «Натура 2000» с использованием данных наблюдений за Землей: пример дельты Нестоса, Греция. Прил. геогр. 2011 , 31 , 312–320. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  19. Дафис, С.; Папастергиаду, Э.; Георгиу, К.; Бабалонас, Д.; Георгиадис, Т.; Папагеоргиу, М.; Лазариду, Т.; Циаусси, В. Греческий проект «среды обитания» Natura 2000: Обзор. Пожизненный контракт B4-32000/94/756 ; Комиссия Европейских Сообществ, Музей естественной истории Гуландриса, Центр греческих биотопов и водно-болотных угодий; Springer: Берлин/Гейдельберг, Германия, 1996. [ Google Scholar ]
  20. Бьянки, Л.; Пачи, М. Эволюционная динамика и тосканское обучение: Sintesi di quarant'anni di richerche. Для.-Ж. Сильвик. Для. Экол. 2008 , 5 , 122. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
  21. Векеманс, X.; Боуэнс, Т.; Лемэр, М.; Ролдан-Руис, И. Данные маркеров амплифицированного полиморфизма длин фрагментов (AFLP) указывают на гомоплазию по размеру и взаимосвязь между степенью гомоплазии и размером фрагмента. Мол. Экол. 2002 , 11 , 139–151. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  22. Пикалл, РОД; Смаус, ЧП Genalex 6: Генетический анализ в Excel. Программное обеспечение популяционной генетики для обучения и исследований. Мол. Экол. Примечания 2006 , 6 , 288–295. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  23. Тафтсоглу, М.; Валканиотис, С.; Папатанасиу, Г.; Климис, Н.; Докас, И. Подробная карта подверженности разжижению дельты реки Нестос, Фракия, Греция, основанная на поверхностной геологии и геоморфологии. Geosciences 2022 , 12 , 361. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  24. ДеХаан, Л.; Эльке, Н.; Шиффер, К.; Вайз, Д.; ДеХаан, Р. Оценка разнообразия североамериканских образцов ложного индиго ( Amorpha fruticosa L.) для корма и биомассы. Жене. Ресурс. Кроп Эвол. 2006 , 53 , 1463–1476. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  25. Ли, М.; Лю, З.; Лю, К.; Чжу, Ф.; Ван, К.; Ван, З.; Ли, Х.; Лан, X.; Гуан, К. Засухоустойчивость табака, сверхэкспрессирующего ген afnac1 Amorpha fruticosa Linn. Передний. Наука о растениях. 2022 , 13 , 980171. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  26. Дат, Северная Каролина; Ли, Дж.-Х.; Лук-порей.; Хонг, Ю.-С.; Ким, Ю.Х.; Ли, Дж. Дж. Фенольные компоненты Amorpha fruticosa , которые ингибируют активацию nf-κb и связанную с ней экспрессию генов. Дж. Нэт. Прод. 2008 , 71 , 1696–1700. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  27. Песня, Ф.; Ци, Д.; Лю, X.; Конг, X.; Гао, Ю.; Чжоу, З.; Ву, К. Протеомный анализ симбиотических белков Glomus mosseae и Amorpha fruticosa . наук. Rep. 2015 , 5 , 18031. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  28. Тодорова Т.; Бояджиев, К.; Шкондров А.; Пырванова П.; Димитрова, М.; Ионкова И.; Крастева И.; Кожухарова Е.; Чанкова, С. Скрининг экстрактов Amorpha fruticosa и Ailanthus altissima на генотоксичность/антигенотоксичность, мутагенность/антимутагенность и канцерогенность/антиканцерогенность. БиоРиск 2022 , 17 , 201–212. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  29. Цветкович, Д.М.; Йованкич, СП; Милутинович, М.Г.; Никодиевич, Д.Д.; Грбович, Ф.Дж.; Чирич, АР; Топузович, доктор медицинских наук; Маркович, С.Д. Противоинвазивная активность Robinia pseudoacacia L. и Amorpha fruticosa L. На клеточной линии рака молочной железы mda-mb-231. Биология 2019 , 74 , 915–928. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
Чужеродные и инвазивные растения угрожают целостности природных экосистем, поскольку большинство из них являются инвазивными, конкурируют с местными растениями и во многих случаях занимают их место в экосистеме. Инвазивные виды характеризуются быстрым распространением за счет производства большого количества потомства, которое может рассеиваться на большие расстояния [ 1 ]. Более того, они имеют высокую выживаемость благодаря своей пластичности, способной реагировать на различные условия окружающей среды. Кроме того, некоторые природные явления могут способствовать их распространению, например, наводнения, ветер, поверхностная эрозия и т. д.
На распространение инвазивных видов также существенно повлияла деятельность человека [ 2 ]. С древних времен чужеродные растения случайно или намеренно переносились в новые места обитания и культивировались как садовые или декоративные растения [ 3 ]. Их распространению способствует также деятельность человека, роль которой двоякая: транспортировка размножающегося материала и изменение среды обитания. Главное преимущество заключается в том, что у них нет физических врагов, которые бы контролировали их население, чтобы они в полной мере использовали свой конкурентный потенциал. Некоторые инвазивные растения также развивают новые механизмы взаимодействия с природными экосистемами [ 4 ]. Одним из таких механизмов является продукция аллелопатических веществ и их выброс в экосистему [ 5].
Amorpha L. ( Fabaceae Juss.: Amorpheae Britains .) — род из 16 видов, произрастающих в Северной Америке [ 6 ]. Эти растения могут представлять собой кустарники, полукустарники или травянистые многолетние растения и встречаются в различных средах обитания, включая прибрежные коридоры, саванны и луга. Многие виды Amorpha имеют очень ограниченное распространение, а некоторые считаются находящимися под угрозой исчезновения [ 7 ].
Amorpha fruticosa L. (куст индиго) — многолетний листопадный кустарник, принадлежащий к семейству Fabaceae и произрастающий в юго-западной части Северной Америки [ 8 ]. Куст индиго был завезен в Европу как декоративное растение [ 5 ]. Его используют как лекарство для лечения ожогов и экземы [ 9 ]. В последние годы ему уделяется особое внимание из-за его биологической активности. Исследования показали, что это растение богато полифенолами и содержит биологически активные ингредиенты. Он также обладает противораковой, противовоспалительной и противомикробной активностью [ 10] .]. Куст индиго – растение, имеющее большую декоративную ценность и используемое при обустройстве городских ландшафтов и при охране склонов. Он может выжить в сухих почвах, но предпочитает берега рек и опушки затопленных лесов, где легко распространяется водой, поскольку его семенные коробочки плавучие [11 ] . Его высокая толерантность к различным климатическим условиям, а также отличная способность к размножению дают ему возможность с легкостью расти за пределами своего естественного распространения [ 12 ]. Сегодня он признан одним из наиболее инвазивных видов в Европе, оказывающим серьезное воздействие на местные экосистемы [ 11 ]. Это светолюбивое растение, конкурирующее за свет, образующее густые заросли, затмевающие местную флору, а это приводит к снижению биоразнообразия [ 11, 12 , 13 ]. Из-за ущерба, который он наносит природным экосистемам и водному хозяйству, следует немедленно принять меры по сокращению/контролю его популяции.
В Греции трансграничные реки, такие как Нестос, Аксиос и др., являются транспортными коридорами для чужеродных видов растений, которые расширяют свой ареал за счет воды [ 14 ]. Однако, помимо конкретного вида транспорта, в последние годы в Грецию были интродуцированы многие зарубежные виды растений, как намеренно (например, декоративные и лекарственные растения), так и непреднамеренно, используя различные способы интродукции [2 ] . Хотя число чужеродных видов велико, не все из них являются инвазивными. Из 343 чужеродных видов только 50 проявляют инвазионное поведение, и большинство из них имеют американское происхождение [ 15 ].
Нестос — трансграничная река Болгарии и Северной Греции. Берет начало от горы Рила на юге Болгарии и проходит между горными хребтами Аймос и Родопы. Его длина составляет 234 км, из них 130 км находится на территории Греции [ 16 ]. Прежде чем впасть в море, он простирается через равнину Хрисуполис и расширяется как дельтовая система с пресноводными озерами, образующими дельту Нестоса. В этой зоне существует приоритетная среда обитания 91E0 (Приложение I Директивы 92/43/EEC), в которой представлены два подтипа: подтип ольховых насаждений ( Alnus Glutinosa ) и подтип тополя белого ( Populus alba ) и вяза ( Ulmusminor ).) стоит. Первый подтип состоит из чистых насаждений ольхи, произрастающих на легких и умеренно легких почвах с очень хорошими физическими свойствами, которые можно охарактеризовать как Calcaric fluvisols. При этом уровень грунтовых вод относительно высокий (90–95 см). Этот подтип встречается между дамбами, местами вблизи берегов рек или в местах, удаленных от них на несколько десятков метров. Второй подтип составляет значительную часть тугайного леса и располагается за пределами дамб. Он состоит из насаждений белого тополя и вяза, которые растут на глубоких и умеренно легких почвах с хорошими физическими свойствами, принадлежащих к типу почв Eutric Fluvisol, без проблем с щелочностью и засоленностью. Уровень грунтовых вод низкий, но сильно колеблется [ 17 ].
Территория вдоль реки существенно изменилась со времен Второй мировой войны [ 18 ]. В 1945 году на этой территории преобладали леса и водно-болотные угодья. В 1960-е годы площадь сельскохозяйственных угодий увеличилась, что привело к уменьшению лесных площадей. Также произошло значительное сокращение площади водно-болотных угодий из-за их преобразования в пастбища. Однако, несмотря на сильное упадок природной экосистемы, в этом районе по-прежнему сохраняется самый обширный речной лес в Греции. Кроме того, равнина реки Нестос имеет важное экологическое значение из-за множества важных мест обитания. Он был классифицирован как водно-болотное угодье международного значения и включен в Рамсарскую конвенцию. Он также защищен Бернской конвенцией, директивами Европейской комиссии и законодательством Греции. Кроме того, он принадлежит к сети Natura 2000.19 ].
В Греции Amorpha fruticosa L. считается инвазивным видом, поскольку это растение способно распространяться на обширной территории. В настоящей работе изучено генетическое разнообразие популяций Amorpha fruticosa L., произрастающих вдоль реки Нестос. Наши цели заключались в том, чтобы (1) определить уровень генетической дифференциации, если она существует, между двумя берегами реки: западным и восточным; (2) оценить степень инбридинга в каждой популяции, а также эффективный размер популяции; и (3) обсудить последствия расширения конкретных видов в естественной экосистеме и, более конкретно, в популяциях местных видов в этом районе.

2. Материалы и методы

2.1. Растительный материал

Сбор образцов листьев проведен на 20 особях Amorpha fruticosa из 2 популяций района реки Нестос (ориентировочные координаты западной популяции A: X: 565671, Y: 4527927 и восточной популяции: X: 566918, Y: 4525481). Экстракцию ДНК из свежей хвои проводили с помощью набора Macherey Nagel Plant (Düren, Северный Рейн-Вестфалия, Германия) в соответствии с протоколом производителя.

2.2. Процедура ПФЛП

Всего 200 нг геномной ДНК фрагментировали расщеплением 4 ед. ферментов EcoRI и MseI при температуре 37°С в течение 3 часов. Расщепленные фрагменты ДНК затем объединяли с адаптерами EcoRI и MseI и полученную смесь лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 от New England Biolabs (Ипсвич, Массачусетс, США). Этот этап лигирования проводили при температуре 26°C в течение 3 часов. Полученную в результате этого процесса ДНК использовали в качестве первичной матрицы для анализа AFLP.
Для этапа преамплификации использовали пару праймеров на основе последовательностей адаптеров EcoRI и MseI с дополнительным селективным нуклеотидом на 3'-конце (EcoRI+A и MseI+C). ПЦР с предварительной амплификацией проводили в общем объеме 20 мкл, который содержал 1X буфер Kapa Taq, 0,2 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl 2., 30 нг каждого праймера (EcoRI+A и MseI+C), 1 единица ДНК-полимеразы Taq от Kapa Biosystems (расположена в Уилмингтоне, Массачусетс, США) и 5 ​​мкл разведенных фрагментов ДНК, полученных в результате реакции расщепления и лигирования. . Условия циклирования ПЦР были следующими: начальная денатурация при 95 °С в течение 30 с, затем 32 цикла денатурации при 95 °С в течение 30 с, отжиг при 56 °С в течение 30 с, удлинение при 72 °С в течение 1 мин. и заключительный этап удлинения при 72 ° C в течение 10 минут. Для подтверждения амплификации образец реакции объемом 5 мкл подвергали электрофорезу в агарозном геле, а оставшиеся 15 мкл разбавляли в 5 раз ТЕ-буфером.
Селективную амплификацию проводили в реакционных объемах объемом 10 мкл, состоящих из 3 мкл разбавленной преселективной матрицы, и с использованием тех же условий реакции, что и на стадии преселективной амплификации, за исключением использования 30 нг праймера MseI и 5 нг праймера EcoRI. за реакцию. Программа циклической селективной амплификации осуществлялась с использованием термоциклера BioRad (Hercules, Калифорния, США) по следующей схеме: начальный цикл денатурации при 95 °C в течение 30 с, отжиг при 65 °C в течение 30 с и удлинение при 95 °C в течение 30 с. 72 °С в течение 1 мин. За этим следовали двенадцать циклов денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг, начинающийся при 65°С в течение 30 с и уменьшающийся на 0,75°С в каждом цикле, и удлинение при 72°С в течение 1 мин. Наконец, двадцать три цикла денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг при 56°С в течение 30 с,
Смеси продуктов f-AFLP подвергали денатурации путем обработки их формамидом при температуре 94 °С в течение 2 мин. Впоследствии эти денатурированные смеси разделяли электрофорезом с использованием генетического анализатора ABI Prism 3730xl, который производится Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Использовали десять комбинаций селективных праймеров AFLP. Затем каждый отдельный гибрид исследовали для определения наличия или отсутствия конкретных фрагментов. Размер обнаруженных фрагментов определяли с использованием программы GeneMapper 4.0 вместе с внутренним стандартом, известным как GS 500 LIZ, который также был предоставлен Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров,20 ].

2.3. Индекс регенерации

Присутствие и плотность A. fruticosa оценивались в приоритетном местообитании 91E0* в районе Нестос на северо-востоке Греции ( рис. 1 ). Пятнадцать (15) участков, каждый площадью 706,86 м 2 , были выбраны случайным образом и равномерно размещены по всей территории обитания 91E0*. В дальнейшем был проведен анализ состава и структуры древесных пород на этих участках. A. fruticosa присутствовала на четырех участках из 15, из которых три располагались на западном берегу реки и один на восточном. У особей A. fruticosa измеряли высоту дерева (м), плотность (особей га -1 ) и индекс регенерации (IR) . IR рассчитывали путем умножения плотности A. fruticosa (на м2 ) по средней высоте A. fruticosa (см) и позволяет оценить степень регенерации [ 20 ].
Экология 04 00041 g001
Рисунок 1. Amorpha fruticosa , распространенная на приоритетном местообитании 91Ε0* в дельте Нестоса, на северо-востоке Греции.

2.4. Сбор данных и статистический анализ данных AFLP

Для преобразования информации о размере аллелей, полученной с помощью GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems, США), в двоичный формат использовался макрос AFLP Excel. Этот макрос присваивал значение «1» присутствующим фрагментам и «0» отсутствующим. Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров, подсчитывали и подвергали дополнительному изучению только согласованные фрагменты, попадающие в диапазон от 150 до 500 пар оснований [ 21 ]. Кроме того, GenAlex v6.0 [ 22 ] использовался для расчета таких параметров, как процент полиморфных полос (P), информационный индекс Шеннона (I) и генетическое разнообразие (He). GenAlex v6.0 также использовался для проведения анализа молекулярной дисперсии (AMOVA), а также для расчета генетических расстояний и анализа главных координат (PCoA).
Подробно, анализ главных координат (PCoA) представляет собой многомерный метод, который позволяет находить и отображать основные закономерности в многомерном наборе данных (например, множественных локусах и множественных образцах). Математика сложна, но, по сути, PCoA — это процесс, с помощью которого основные оси вариаций располагаются в многомерном наборе данных. Для многомерных наборов данных каждая последующая ось объясняет пропорционально меньшую часть общей вариации, так что при наличии отдельных групп первые две или три оси обычно выявляют большую часть разделения между ними. Предусмотрено четыре различных варианта: два основаны на преобразовании матрицы расстояний в ковариационную матрицу, а два работают непосредственно на основе входной матрицы расстояний. Матрица расстояний используется как пул для расчета распределения по осям [22 ].

2.5. Информация о среде обитания 91E0*

Местообитание 91E0* в дельте реки Нестос простирается на небольших высотах (<100 м над уровнем моря) с поверхностями от умеренного до плоского рельефа (уклон 0–10%) (выборка личных данных Коракаки Э. и Карецоса Г.). В его состав входят доминирующие виды деревьев, такие как Fraxinus excelsior L. и Alnus Glutinosa (L.) Gaertn., а также Fraxinus angustifolia Vahl, Salix alba L., Populus alba L., Pinus nigra JF Arnold, Juglans regia L., Cornus sanguinea. L., Ulmus major Mill. и Quercus robur subsp. pedunculiflora (К. Кох) Меницкого. Существует множество вьющихся растений (например,Periploca graeca L. и др.), а травянистый ярус неизменно включает множество видов (например, Aegopodium podagraria L., Hedera helix L., Lysimachia punctata L., Circaea lutetiana L., Arum maculatum L. и др.) (Solomou Выборка персональных данных А. и Карецоса Г.). Дельта Нестоса образована аллювиальными отложениями реки Нестос. Речные отложения состоят из аллювиальных отложений глин, песков и гравия, тогда как пойменные отложения состоят преимущественно из глин и песков [ 23 ].

3. Результаты

3.1. Генетические результаты

Семь комбинаций праймеров AFLP дали 313 локусов для двух популяций. По результатам AFLP, восточная популяция имела полиморфизм 83,39%, а западная — 83,07%. Средняя ожидаемая гетерозиготность (He) составляла 0,127, а западная популяция имела среднюю гетерозиготность немного выше (0,136), чем восточная (0,119). Параметры генетического разнообразия представлены в Таблице 1 вместе с эпигенетическими результатами.
Таблица 1. Среднее значение и стандартная ошибка (SE) для Na (количество аллелей), Ne (количество эффективных аллелей), I (информационный индекс Шеннона) и He (ожидаемая гетерозиготность).
AMOVA (анализ молекулярной дисперсии) определил 97% генетических вариаций внутри популяций и 3% только между популяциями ( рис. 2 ). Анализ основных координат объяснил 16,89% дисперсии ( рис. 3 ).
Экология 04 00041 g002
Рисунок 2. Анализ молекулярной дисперсии среди популяций и внутри них: дисперсия среди популяций составила 3%, а внутри - 97%. Генетическая вариация фрагментов AFLP, использованных для анализа AMOVA.
Экология 04 00041 g003
Рисунок 3. Анализ основных координат объяснил 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы в зависимости от происхождения популяций. На рисунке обозначена небольшая группировка двух популяций, полученная на основе матрицы генетических расстояний генотипов.

3.2. Плотность и индекс регенерации

На четырех участках было зарегистрировано в общей сложности 233 особи A. fruticosa , в результате чего средняя плотность составила 824,07 растений на гектар. Примечательно, что плотность A. fruticosa и индекс регенерации (IR) оказались выше у популяции, проживающей на западном берегу реки, по сравнению с восточным берегом реки. Однако стоит отметить, что средняя высота деревьев была выше на восточном берегу реки, как указано в Таблице 2 . В аллювиальном лесу наиболее широко распространено возобновление чужеродных видов A. fruticosa и A. negundo (личное сообщение Коракаки).
Таблица 2. Средняя высота, средняя плотность и средний индекс регенерации (IR).

4. Дискуссия

Сообщается, что ложное индиго ( Amorpha fruticosa L.) является неместным [ 15 ], и недавние наблюдения зафиксировали его присутствие на значительных территориях вдоль рек Ардас, Эврос и Нестос на северо-востоке Греции, что указывает на его завоз из соседней Болгарии. , возможно, через речной транспорт генетического материала. В прибрежных лесах реки Нестос на северо-востоке Греции A. fruticosa демонстрирует значительную динамику регенерации и, по-видимому, подавляет растительность в важных приоритетных местообитаниях.
В этом исследовании мы оценили генетическое разнообразие двух популяций с западного и восточного берегов реки Нестос, чтобы оценить, имеют ли они различия в генетических параметрах или имеют ли они схожие индексы генетического разнообразия. По оценкам локусов AFLP, гетерозиготность западной популяции была немного выше, но существенно не отличалась от восточной популяции. Более того, как показал анализ AMOVA, большая часть генетических вариаций наблюдалась внутри популяций (97%). Анализ основных координат объяснил лишь 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы по происхождению популяций. Главный вывод генетического анализа заключался в том, что западные и восточные популяции имеют общий генетический фонд, который поступает с водой через реку Нестос.
Что касается аналогичных исследований, авторы не обнаружили никаких упоминаний о генетическом разнообразии с использованием молекулярных маркеров растений A. fruticosa . Однако есть одно исследование [ 24 ], в котором они измерили 47 агрономических и морфологических признаков энергии биомассы. Результаты показали, что на все признаки повлияли образцы, и это ключ, который также может демонстрировать генетическое содержание, которое, вероятно, влияет на изменчивость. Кроме того, были проведены исследования экспрессии генов, связанных с засухой [ 25 ], фенольных компонентов [ 26 ], протеомного анализа симбиотических белков [ 27 ] и исследований рака [ 28 , 29] .]. Вышеупомянутые исследования с одной точки зрения указывают на значение A. fruticosa , хотя мы не можем исключить негативное воздействие, которое он оказывает на экосистемы из-за его быстрого распространения. Этот инвазивный вид может проникнуть в луговые сообщества и быстро превратить среду обитания в густые и однородные заросли. Он вытесняет местные растения и нарушает естественную сукцессию растений и биоразнообразие. Это представляет собой серьезную угрозу, поскольку подавляет местные виды деревьев в приоритетном аллювиальном лесу дельты Нестоса (91E0*). Кроме того, это ставит под угрозу выживание видов Emys orbcularis , Testudo Hermanni и Callimorpha Quadripunctaria *, поскольку они зависят от этих мест обитания.
Согласно нашим выводам, A. fruticosa более активно развивается на западном берегу реки Нестос, что представляет значительный риск для биоразнообразия и подавления местных видов деревьев в аллювиальных лесах региона Нестос. Таким образом, любые природоохранные меры и действия по управлению лесами, направленные на ограничение распространения A. fruticosa , должны быть приоритетными на этом берегу реки. Меры по сохранению необходимы для защиты и поддержания этой естественной среды обитания, которая представляет значительный интерес для сообщества. Действия также должны быть направлены на повышение осведомленности об угрозах, с которыми сталкиваются аллювиальные леса, и на обеспечение их долгосрочной защиты и сохранения. Этот результат ИК дает нам первое указание на то, что A. fruticosaбудет более обширным на западной стороне, и результат небольшой, но более высокой гетерозиготности согласуется с текущим результатом. С 2021 года Институт средиземноморских лесных экосистем (ELGO-DIMITRA) разрабатывает различные экспериментальные методы лечения, чтобы изучить возможные решения по ограничению распространения A. fruticosa .
Наконец, в этом исследовании мы обнаружили аналогичный генетический пул с восточного и западного берегов реки Нестос, который, вероятно, происходит из Болгарии. Будущие исследования должны также включать генетический анализ этих болгарских популяций. Считается необходимым продолжить исследования и изучение A. fruticosa в ближайшие годы, чтобы было более полное знание этого вида и его влияния на экосистему, чтобы затем можно было создать и создать систему управления этим видом. его преимущества можно использовать, не оказывая негативного воздействия на экосистему.

5. Выводы

Первое сообщение о генетическом разнообразии и распространении чужеродного вида Amorpha fruticosa L. было впервые использовано за рекой Нестос в Греции. Мы изучили две популяции, одну с западной стороны и одну с восточной стороны, с маркерами AFLP, и не обнаружили дифференциации между ними. Это указывает на то, что, вероятно, один генетический пул был передан через реку из Болгарии, и будущие исследования должны также охватывать болгарские популяции. Кроме того, проведенная первая оценка состояния регенерации также указывает на расширение вида. Это обязательный шаг для оценки и предложения мер управления с целью сохранения и ограничения распространения вида, который оказывает существенное негативное воздействие на среду обитания 91E0*.

Вклад автора

Концептуализация, EVA и EK; методология, EVA, EK, EM, ADS, GM и ГК; программное обеспечение, EVA, EM и EK; проверка, все; ресурсы, EVA и EK; курирование данных, EVA и EK; письмо — подготовка оригинального проекта, EVA, EK, EM и ADS; написание — просмотр и редактирование, все; надзор, EVA и EK; администрация проекта, ЭК; приобретение финансирования, Е.К. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Это исследование финансировалось проектом LIFE PRIMED, LIFE17 NAT/GR/000511, который софинансируется Греческим зеленым фондом (GRFU).

Заявление о доступности данных

Данные недоступны.

Конфликт интересов

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Рекомендации

  1. Ричардсон, DM; Пышек, П.; Рейманек, М.; Барбур, Миннесота; Панетта, Флорида; Уэст, К.Дж. Натурализация и вторжение чужеродных растений: концепции и определения. Дайверы. Распредел. 2000 , 6 , 93–107. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  2. Коракаки, ​​Э.; Легакис, А.; Кацаневакис, С.; Кулелис, П.; Аврамиду, Э.; Сулиоти, Н.; Петракис, П. Инвазивные чужеродные виды Греции. Обсервация инвазивных чужеродных видов. Проблемы вокруг света 2021 , 3 , 124–189. [ Академика Google ]
  3. Мияваки, С.; Вашитани, И. Инвазивные чужеродные виды растений в прибрежных районах Японии: вклад сельскохозяйственных сорняков, видов восстановления растительности и аквакультурных видов. Глоб. Окружающая среда. Рез.-англ. Эд. 2004 , 8 , 89–101. [ Академика Google ]
  4. Каллауэй, РМ; Ашехуг, Э.Т. Инвазивные растения против их новых и старых соседей: механизм экзотического вторжения. Наука 2000 , 290 , 521–523. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  5. Иванеску, Б.; Лунгу, К.; Власе, Л.; Градинару, AC; Тухилус, К. ВЭЖХ-анализ фенольных соединений, антиоксидантной и противомикробной активности Amorpha fruticosa L. Экстракты. Дж. Плант Дев. 2019 , 26 , 77. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  6. Штрауб, Южная Каролина; Извините, бакалавр; Уикли, А.С. Amorpha confusa , новое название старой Amorpha (Fabaceae: Amorpheae). Дж. Бот. Рез. Инст. Техас, 2009 г. , 151–155. [ Академика Google ]
  7. Штрауб, Южная Каролина; Дойл, Дж. Дж. Молекулярная филогенетика Amorpha (Fabaceae): оценка монофилии, видовых отношений и полиплоидного происхождения. Мол. Филогенетика Эвол. 2014 , 76 , 49–66. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  8. Лю, Дж.; Ван, ET; Chen, WX Разнообразные ризобии, связанные с древесными бобовыми культурами Wisteria sinensis , Cercis Racemosa и Amorpha fruticosa, выращиваемыми в умеренной зоне Китая. Сист. Прил. Микробиол. 2005 , 28 , 465–477. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  9. Китайский, П. Словарь китайской Materia Medica ; Китайская научно-техническая медицинская пресса: Пекин, Китай, 1997. [ Google Scholar ]
  10. Митчер, Луизиана; Парк, Ю.Х.; Альшамма, А.; Хадсон, ПБ; Хаас, Т. Аморфрутин a и b, бибензиловые противомикробные средства из Amorpha fruticosa . Фитохимия 1981 , 20 , 781–785. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  11. Крпан, АП; Томашич, Ж.; Башич Палкович, П. Биопотенциал индигобуша ( Amorpha fruticosa L.) – второй год исследования. Список Шумарского. 2011 , 135 , 103–112. [ Академика Google ]
  12. Кожухарова Е.; Матковский, А.; Возняк, Д.; Симеонова Р.; Найчов З.; Малайнер, К.; Мокан, А.; Набави, С.М.; Атанасов А.Г. Amorpha fruticosa – вредоносное инвазионное чужеродное растение в Европе или лекарственное растение от болезней обмена веществ? Передний. Фармакол. 2017 , 8 , 333. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  13. Сигетвари, К. Первые шаги по восстановлению пойменного луга после десятилетия доминирования инвазивного кустарника-трансформера Amorpha fruticosa L. Tiscia 2002 , 33 , 67–77. [ Академика Google ]
  14. Педашенко, Л.П.; Апостолова, И.И.; Васильев К.В. Невселенность Amorpha fruticosa в различных местообитаниях нижнего Дуная. Фитол. Балк. 2012 , 18 , 285–291. [ Академика Google ]
  15. Ариануцу, М.; Базос, И.; Делипетру, П.; Коккорис, Ю. Инопланетная флора Греции: таксономия, особенности жизни и предпочтения среды обитания. Биол. Вторжения 2010 , 12 , 3525–3549. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  16. Самарас, АГ; Коутитас, К.Г. Моделирование воздействия на прибрежную морфологию управления водными ресурсами в трансграничных речных бассейнах: пример реки Нестос. Менеджер. Окружающая среда. Квал. Межд. Дж. 2008 , 19 , 455–466. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  17. Декамп, Х.; Декамп, О. Средиземноморские прибрежные леса ; Сохранение водно-болотных угодий Средиземноморья; Тур дю Валат: Арль, Франция, 2001 г. [ Google Scholar ]
  18. Маллинис, Г.; Эмманолудис, Д.; Яннакопулос, В.; Марис, Ф.; Куциас, Н. Картирование и интерпретация исторических изменений растительного покрова/землепользования на участке «Натура 2000» с использованием данных наблюдений за Землей: пример дельты Нестоса, Греция. Прил. геогр. 2011 , 31 , 312–320. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  19. Дафис, С.; Папастергиаду, Э.; Георгиу, К.; Бабалонас, Д.; Георгиадис, Т.; Папагеоргиу, М.; Лазариду, Т.; Циаусси, В. Греческий проект «среды обитания» Natura 2000: Обзор. Пожизненный контракт B4-32000/94/756 ; Комиссия Европейских Сообществ, Музей естественной истории Гуландриса, Центр греческих биотопов и водно-болотных угодий; Springer: Берлин/Гейдельберг, Германия, 1996. [ Google Scholar ]
  20. Бьянки, Л.; Пачи, М. Эволюционная динамика и тосканское обучение: Sintesi di quarant'anni di richerche. Для.-Ж. Сильвик. Для. Экол. 2008 , 5 , 122. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
  21. Векеманс, X.; Боуэнс, Т.; Лемэр, М.; Ролдан-Руис, И. Данные маркеров амплифицированного полиморфизма длин фрагментов (AFLP) указывают на гомоплазию по размеру и взаимосвязь между степенью гомоплазии и размером фрагмента. Мол. Экол. 2002 , 11 , 139–151. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  22. Пикалл, РОД; Смаус, ЧП Genalex 6: Генетический анализ в Excel. Программное обеспечение популяционной генетики для обучения и исследований. Мол. Экол. Примечания 2006 , 6 , 288–295. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  23. Тафтсоглу, М.; Валканиотис, С.; Папатанасиу, Г.; Климис, Н.; Докас, И. Подробная карта подверженности разжижению дельты реки Нестос, Фракия, Греция, основанная на поверхностной геологии и геоморфологии. Geosciences 2022 , 12 , 361. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  24. ДеХаан, Л.; Эльке, Н.; Шиффер, К.; Вайз, Д.; ДеХаан, Р. Оценка разнообразия североамериканских образцов ложного индиго ( Amorpha fruticosa L.) для корма и биомассы. Жене. Ресурс. Кроп Эвол. 2006 , 53 , 1463–1476. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  25. Ли, М.; Лю, З.; Лю, К.; Чжу, Ф.; Ван, К.; Ван, З.; Ли, Х.; Лан, X.; Гуан, К. Засухоустойчивость табака, сверхэкспрессирующего ген afnac1 Amorpha fruticosa Linn. Передний. Наука о растениях. 2022 , 13 , 980171. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  26. Дат, Северная Каролина; Ли, Дж.-Х.; Лук-порей.; Хонг, Ю.-С.; Ким, Ю.Х.; Ли, Дж. Дж. Фенольные компоненты Amorpha fruticosa , которые ингибируют активацию nf-κb и связанную с ней экспрессию генов. Дж. Нэт. Прод. 2008 , 71 , 1696–1700. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  27. Песня, Ф.; Ци, Д.; Лю, X.; Конг, X.; Гао, Ю.; Чжоу, З.; Ву, К. Протеомный анализ симбиотических белков Glomus mosseae и Amorpha fruticosa . наук. Rep. 2015 , 5 , 18031. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  28. Тодорова Т.; Бояджиев, К.; Шкондров А.; Пырванова П.; Димитрова, М.; Ионкова И.; Крастева И.; Кожухарова Е.; Чанкова, С. Скрининг экстрактов Amorpha fruticosa и Ailanthus altissima на генотоксичность/антигенотоксичность, мутагенность/антимутагенность и канцерогенность/антиканцерогенность. БиоРиск 2022 , 17 , 201–212. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  29. Цветкович, Д.М.; Йованкич, СП; Милутинович, М.Г.; Никодиевич, Д.Д.; Грбович, Ф.Дж.; Чирич, АР; Топузович, доктор медицинских наук; Маркович, С.Д. Противоинвазивная активность Robinia pseudoacacia L. и Amorpha fruticosa L. На клеточной линии рака молочной железы mda-mb-231. Биология 2019 , 74 , 915–928. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
Чужеродные и инвазивные растения угрожают целостности природных экосистем, поскольку большинство из них являются инвазивными, конкурируют с местными растениями и во многих случаях занимают их место в экосистеме. Инвазивные виды характеризуются быстрым распространением за счет производства большого количества потомства, которое может рассеиваться на большие расстояния [ 1 ]. Более того, они имеют высокую выживаемость благодаря своей пластичности, способной реагировать на различные условия окружающей среды. Кроме того, некоторые природные явления могут способствовать их распространению, например, наводнения, ветер, поверхностная эрозия и т. д.
На распространение инвазивных видов также существенно повлияла деятельность человека [ 2 ]. С древних времен чужеродные растения случайно или намеренно переносились в новые места обитания и культивировались как садовые или декоративные растения [ 3 ]. Их распространению способствует также деятельность человека, роль которой двоякая: транспортировка размножающегося материала и изменение среды обитания. Главное преимущество заключается в том, что у них нет физических врагов, которые бы контролировали их население, чтобы они в полной мере использовали свой конкурентный потенциал. Некоторые инвазивные растения также развивают новые механизмы взаимодействия с природными экосистемами [ 4 ]. Одним из таких механизмов является продукция аллелопатических веществ и их выброс в экосистему [ 5].
Amorpha L. ( Fabaceae Juss.: Amorpheae Britains .) — род из 16 видов, произрастающих в Северной Америке [ 6 ]. Эти растения могут представлять собой кустарники, полукустарники или травянистые многолетние растения и встречаются в различных средах обитания, включая прибрежные коридоры, саванны и луга. Многие виды Amorpha имеют очень ограниченное распространение, а некоторые считаются находящимися под угрозой исчезновения [ 7 ].
Amorpha fruticosa L. (куст индиго) — многолетний листопадный кустарник, принадлежащий к семейству Fabaceae и произрастающий в юго-западной части Северной Америки [ 8 ]. Куст индиго был завезен в Европу как декоративное растение [ 5 ]. Его используют как лекарство для лечения ожогов и экземы [ 9 ]. В последние годы ему уделяется особое внимание из-за его биологической активности. Исследования показали, что это растение богато полифенолами и содержит биологически активные ингредиенты. Он также обладает противораковой, противовоспалительной и противомикробной активностью [ 10] .]. Куст индиго – растение, имеющее большую декоративную ценность и используемое при обустройстве городских ландшафтов и при охране склонов. Он может выжить в сухих почвах, но предпочитает берега рек и опушки затопленных лесов, где легко распространяется водой, поскольку его семенные коробочки плавучие [11 ] . Его высокая толерантность к различным климатическим условиям, а также отличная способность к размножению дают ему возможность с легкостью расти за пределами своего естественного распространения [ 12 ]. Сегодня он признан одним из наиболее инвазивных видов в Европе, оказывающим серьезное воздействие на местные экосистемы [ 11 ]. Это светолюбивое растение, конкурирующее за свет, образующее густые заросли, затмевающие местную флору, а это приводит к снижению биоразнообразия [ 11, 12 , 13 ]. Из-за ущерба, который он наносит природным экосистемам и водному хозяйству, следует немедленно принять меры по сокращению/контролю его популяции.
В Греции трансграничные реки, такие как Нестос, Аксиос и др., являются транспортными коридорами для чужеродных видов растений, которые расширяют свой ареал за счет воды [ 14 ]. Однако, помимо конкретного вида транспорта, в последние годы в Грецию были интродуцированы многие зарубежные виды растений, как намеренно (например, декоративные и лекарственные растения), так и непреднамеренно, используя различные способы интродукции [2 ] . Хотя число чужеродных видов велико, не все из них являются инвазивными. Из 343 чужеродных видов только 50 проявляют инвазионное поведение, и большинство из них имеют американское происхождение [ 15 ].
Нестос — трансграничная река Болгарии и Северной Греции. Берет начало от горы Рила на юге Болгарии и проходит между горными хребтами Аймос и Родопы. Его длина составляет 234 км, из них 130 км находится на территории Греции [ 16 ]. Прежде чем впасть в море, он простирается через равнину Хрисуполис и расширяется как дельтовая система с пресноводными озерами, образующими дельту Нестоса. В этой зоне существует приоритетная среда обитания 91E0 (Приложение I Директивы 92/43/EEC), в которой представлены два подтипа: подтип ольховых насаждений ( Alnus Glutinosa ) и подтип тополя белого ( Populus alba ) и вяза ( Ulmusminor ).) стоит. Первый подтип состоит из чистых насаждений ольхи, произрастающих на легких и умеренно легких почвах с очень хорошими физическими свойствами, которые можно охарактеризовать как Calcaric fluvisols. При этом уровень грунтовых вод относительно высокий (90–95 см). Этот подтип встречается между дамбами, местами вблизи берегов рек или в местах, удаленных от них на несколько десятков метров. Второй подтип составляет значительную часть тугайного леса и располагается за пределами дамб. Он состоит из насаждений белого тополя и вяза, которые растут на глубоких и умеренно легких почвах с хорошими физическими свойствами, принадлежащих к типу почв Eutric Fluvisol, без проблем с щелочностью и засоленностью. Уровень грунтовых вод низкий, но сильно колеблется [ 17 ].
Территория вдоль реки существенно изменилась со времен Второй мировой войны [ 18 ]. В 1945 году на этой территории преобладали леса и водно-болотные угодья. В 1960-е годы площадь сельскохозяйственных угодий увеличилась, что привело к уменьшению лесных площадей. Также произошло значительное сокращение площади водно-болотных угодий из-за их преобразования в пастбища. Однако, несмотря на сильное упадок природной экосистемы, в этом районе по-прежнему сохраняется самый обширный речной лес в Греции. Кроме того, равнина реки Нестос имеет важное экологическое значение из-за множества важных мест обитания. Он был классифицирован как водно-болотное угодье международного значения и включен в Рамсарскую конвенцию. Он также защищен Бернской конвенцией, директивами Европейской комиссии и законодательством Греции. Кроме того, он принадлежит к сети Natura 2000.19 ].
В Греции Amorpha fruticosa L. считается инвазивным видом, поскольку это растение способно распространяться на обширной территории. В настоящей работе изучено генетическое разнообразие популяций Amorpha fruticosa L., произрастающих вдоль реки Нестос. Наши цели заключались в том, чтобы (1) определить уровень генетической дифференциации, если она существует, между двумя берегами реки: западным и восточным; (2) оценить степень инбридинга в каждой популяции, а также эффективный размер популяции; и (3) обсудить последствия расширения конкретных видов в естественной экосистеме и, более конкретно, в популяциях местных видов в этом районе.

2. Материалы и методы

2.1. Растительный материал

Сбор образцов листьев проведен на 20 особях Amorpha fruticosa из 2 популяций района реки Нестос (ориентировочные координаты западной популяции A: X: 565671, Y: 4527927 и восточной популяции: X: 566918, Y: 4525481). Экстракцию ДНК из свежей хвои проводили с помощью набора Macherey Nagel Plant (Düren, Северный Рейн-Вестфалия, Германия) в соответствии с протоколом производителя.

2.2. Процедура ПФЛП

Всего 200 нг геномной ДНК фрагментировали расщеплением 4 ед. ферментов EcoRI и MseI при температуре 37°С в течение 3 часов. Расщепленные фрагменты ДНК затем объединяли с адаптерами EcoRI и MseI и полученную смесь лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 от New England Biolabs (Ипсвич, Массачусетс, США). Этот этап лигирования проводили при температуре 26°C в течение 3 часов. Полученную в результате этого процесса ДНК использовали в качестве первичной матрицы для анализа AFLP.
Для этапа преамплификации использовали пару праймеров на основе последовательностей адаптеров EcoRI и MseI с дополнительным селективным нуклеотидом на 3'-конце (EcoRI+A и MseI+C). ПЦР с предварительной амплификацией проводили в общем объеме 20 мкл, который содержал 1X буфер Kapa Taq, 0,2 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl 2., 30 нг каждого праймера (EcoRI+A и MseI+C), 1 единица ДНК-полимеразы Taq от Kapa Biosystems (расположена в Уилмингтоне, Массачусетс, США) и 5 ​​мкл разведенных фрагментов ДНК, полученных в результате реакции расщепления и лигирования. . Условия циклирования ПЦР были следующими: начальная денатурация при 95 °С в течение 30 с, затем 32 цикла денатурации при 95 °С в течение 30 с, отжиг при 56 °С в течение 30 с, удлинение при 72 °С в течение 1 мин. и заключительный этап удлинения при 72 ° C в течение 10 минут. Для подтверждения амплификации образец реакции объемом 5 мкл подвергали электрофорезу в агарозном геле, а оставшиеся 15 мкл разбавляли в 5 раз ТЕ-буфером.
Селективную амплификацию проводили в реакционных объемах объемом 10 мкл, состоящих из 3 мкл разбавленной преселективной матрицы, и с использованием тех же условий реакции, что и на стадии преселективной амплификации, за исключением использования 30 нг праймера MseI и 5 нг праймера EcoRI. за реакцию. Программа циклической селективной амплификации осуществлялась с использованием термоциклера BioRad (Hercules, Калифорния, США) по следующей схеме: начальный цикл денатурации при 95 °C в течение 30 с, отжиг при 65 °C в течение 30 с и удлинение при 95 °C в течение 30 с. 72 °С в течение 1 мин. За этим следовали двенадцать циклов денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг, начинающийся при 65°С в течение 30 с и уменьшающийся на 0,75°С в каждом цикле, и удлинение при 72°С в течение 1 мин. Наконец, двадцать три цикла денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг при 56°С в течение 30 с,
Смеси продуктов f-AFLP подвергали денатурации путем обработки их формамидом при температуре 94 °С в течение 2 мин. Впоследствии эти денатурированные смеси разделяли электрофорезом с использованием генетического анализатора ABI Prism 3730xl, который производится Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Использовали десять комбинаций селективных праймеров AFLP. Затем каждый отдельный гибрид исследовали для определения наличия или отсутствия конкретных фрагментов. Размер обнаруженных фрагментов определяли с использованием программы GeneMapper 4.0 вместе с внутренним стандартом, известным как GS 500 LIZ, который также был предоставлен Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров,20 ].

2.3. Индекс регенерации

Присутствие и плотность A. fruticosa оценивались в приоритетном местообитании 91E0* в районе Нестос на северо-востоке Греции ( рис. 1 ). Пятнадцать (15) участков, каждый площадью 706,86 м 2 , были выбраны случайным образом и равномерно размещены по всей территории обитания 91E0*. В дальнейшем был проведен анализ состава и структуры древесных пород на этих участках. A. fruticosa присутствовала на четырех участках из 15, из которых три располагались на западном берегу реки и один на восточном. У особей A. fruticosa измеряли высоту дерева (м), плотность (особей га -1 ) и индекс регенерации (IR) . IR рассчитывали путем умножения плотности A. fruticosa (на м2 ) по средней высоте A. fruticosa (см) и позволяет оценить степень регенерации [ 20 ].
Экология 04 00041 g001
Рисунок 1. Amorpha fruticosa , распространенная на приоритетном местообитании 91Ε0* в дельте Нестоса, на северо-востоке Греции.

2.4. Сбор данных и статистический анализ данных AFLP

Для преобразования информации о размере аллелей, полученной с помощью GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems, США), в двоичный формат использовался макрос AFLP Excel. Этот макрос присваивал значение «1» присутствующим фрагментам и «0» отсутствующим. Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров, подсчитывали и подвергали дополнительному изучению только согласованные фрагменты, попадающие в диапазон от 150 до 500 пар оснований [ 21 ]. Кроме того, GenAlex v6.0 [ 22 ] использовался для расчета таких параметров, как процент полиморфных полос (P), информационный индекс Шеннона (I) и генетическое разнообразие (He). GenAlex v6.0 также использовался для проведения анализа молекулярной дисперсии (AMOVA), а также для расчета генетических расстояний и анализа главных координат (PCoA).
Подробно, анализ главных координат (PCoA) представляет собой многомерный метод, который позволяет находить и отображать основные закономерности в многомерном наборе данных (например, множественных локусах и множественных образцах). Математика сложна, но, по сути, PCoA — это процесс, с помощью которого основные оси вариаций располагаются в многомерном наборе данных. Для многомерных наборов данных каждая последующая ось объясняет пропорционально меньшую часть общей вариации, так что при наличии отдельных групп первые две или три оси обычно выявляют большую часть разделения между ними. Предусмотрено четыре различных варианта: два основаны на преобразовании матрицы расстояний в ковариационную матрицу, а два работают непосредственно на основе входной матрицы расстояний. Матрица расстояний используется как пул для расчета распределения по осям [22 ].

2.5. Информация о среде обитания 91E0*

Местообитание 91E0* в дельте реки Нестос простирается на небольших высотах (<100 м над уровнем моря) с поверхностями от умеренного до плоского рельефа (уклон 0–10%) (выборка личных данных Коракаки Э. и Карецоса Г.). В его состав входят доминирующие виды деревьев, такие как Fraxinus excelsior L. и Alnus Glutinosa (L.) Gaertn., а также Fraxinus angustifolia Vahl, Salix alba L., Populus alba L., Pinus nigra JF Arnold, Juglans regia L., Cornus sanguinea. L., Ulmus major Mill. и Quercus robur subsp. pedunculiflora (К. Кох) Меницкого. Существует множество вьющихся растений (например,Periploca graeca L. и др.), а травянистый ярус неизменно включает множество видов (например, Aegopodium podagraria L., Hedera helix L., Lysimachia punctata L., Circaea lutetiana L., Arum maculatum L. и др.) (Solomou Выборка персональных данных А. и Карецоса Г.). Дельта Нестоса образована аллювиальными отложениями реки Нестос. Речные отложения состоят из аллювиальных отложений глин, песков и гравия, тогда как пойменные отложения состоят преимущественно из глин и песков [ 23 ].

3. Результаты

3.1. Генетические результаты

Семь комбинаций праймеров AFLP дали 313 локусов для двух популяций. По результатам AFLP, восточная популяция имела полиморфизм 83,39%, а западная — 83,07%. Средняя ожидаемая гетерозиготность (He) составляла 0,127, а западная популяция имела среднюю гетерозиготность немного выше (0,136), чем восточная (0,119). Параметры генетического разнообразия представлены в Таблице 1 вместе с эпигенетическими результатами.
Таблица 1. Среднее значение и стандартная ошибка (SE) для Na (количество аллелей), Ne (количество эффективных аллелей), I (информационный индекс Шеннона) и He (ожидаемая гетерозиготность).
AMOVA (анализ молекулярной дисперсии) определил 97% генетических вариаций внутри популяций и 3% только между популяциями ( рис. 2 ). Анализ основных координат объяснил 16,89% дисперсии ( рис. 3 ).
Экология 04 00041 g002
Рисунок 2. Анализ молекулярной дисперсии среди популяций и внутри них: дисперсия среди популяций составила 3%, а внутри - 97%. Генетическая вариация фрагментов AFLP, использованных для анализа AMOVA.
Экология 04 00041 g003
Рисунок 3. Анализ основных координат объяснил 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы в зависимости от происхождения популяций. На рисунке обозначена небольшая группировка двух популяций, полученная на основе матрицы генетических расстояний генотипов.

3.2. Плотность и индекс регенерации

На четырех участках было зарегистрировано в общей сложности 233 особи A. fruticosa , в результате чего средняя плотность составила 824,07 растений на гектар. Примечательно, что плотность A. fruticosa и индекс регенерации (IR) оказались выше у популяции, проживающей на западном берегу реки, по сравнению с восточным берегом реки. Однако стоит отметить, что средняя высота деревьев была выше на восточном берегу реки, как указано в Таблице 2 . В аллювиальном лесу наиболее широко распространено возобновление чужеродных видов A. fruticosa и A. negundo (личное сообщение Коракаки).
Таблица 2. Средняя высота, средняя плотность и средний индекс регенерации (IR).

4. Дискуссия

Сообщается, что ложное индиго ( Amorpha fruticosa L.) является неместным [ 15 ], и недавние наблюдения зафиксировали его присутствие на значительных территориях вдоль рек Ардас, Эврос и Нестос на северо-востоке Греции, что указывает на его завоз из соседней Болгарии. , возможно, через речной транспорт генетического материала. В прибрежных лесах реки Нестос на северо-востоке Греции A. fruticosa демонстрирует значительную динамику регенерации и, по-видимому, подавляет растительность в важных приоритетных местообитаниях.
В этом исследовании мы оценили генетическое разнообразие двух популяций с западного и восточного берегов реки Нестос, чтобы оценить, имеют ли они различия в генетических параметрах или имеют ли они схожие индексы генетического разнообразия. По оценкам локусов AFLP, гетерозиготность западной популяции была немного выше, но существенно не отличалась от восточной популяции. Более того, как показал анализ AMOVA, большая часть генетических вариаций наблюдалась внутри популяций (97%). Анализ основных координат объяснил лишь 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы по происхождению популяций. Главный вывод генетического анализа заключался в том, что западные и восточные популяции имеют общий генетический фонд, который поступает с водой через реку Нестос.
Что касается аналогичных исследований, авторы не обнаружили никаких упоминаний о генетическом разнообразии с использованием молекулярных маркеров растений A. fruticosa . Однако есть одно исследование [ 24 ], в котором они измерили 47 агрономических и морфологических признаков энергии биомассы. Результаты показали, что на все признаки повлияли образцы, и это ключ, который также может демонстрировать генетическое содержание, которое, вероятно, влияет на изменчивость. Кроме того, были проведены исследования экспрессии генов, связанных с засухой [ 25 ], фенольных компонентов [ 26 ], протеомного анализа симбиотических белков [ 27 ] и исследований рака [ 28 , 29] .]. Вышеупомянутые исследования с одной точки зрения указывают на значение A. fruticosa , хотя мы не можем исключить негативное воздействие, которое он оказывает на экосистемы из-за его быстрого распространения. Этот инвазивный вид может проникнуть в луговые сообщества и быстро превратить среду обитания в густые и однородные заросли. Он вытесняет местные растения и нарушает естественную сукцессию растений и биоразнообразие. Это представляет собой серьезную угрозу, поскольку подавляет местные виды деревьев в приоритетном аллювиальном лесу дельты Нестоса (91E0*). Кроме того, это ставит под угрозу выживание видов Emys orbcularis , Testudo Hermanni и Callimorpha Quadripunctaria *, поскольку они зависят от этих мест обитания.
Согласно нашим выводам, A. fruticosa более активно развивается на западном берегу реки Нестос, что представляет значительный риск для биоразнообразия и подавления местных видов деревьев в аллювиальных лесах региона Нестос. Таким образом, любые природоохранные меры и действия по управлению лесами, направленные на ограничение распространения A. fruticosa , должны быть приоритетными на этом берегу реки. Меры по сохранению необходимы для защиты и поддержания этой естественной среды обитания, которая представляет значительный интерес для сообщества. Действия также должны быть направлены на повышение осведомленности об угрозах, с которыми сталкиваются аллювиальные леса, и на обеспечение их долгосрочной защиты и сохранения. Этот результат ИК дает нам первое указание на то, что A. fruticosaбудет более обширным на западной стороне, и результат небольшой, но более высокой гетерозиготности согласуется с текущим результатом. С 2021 года Институт средиземноморских лесных экосистем (ELGO-DIMITRA) разрабатывает различные экспериментальные методы лечения, чтобы изучить возможные решения по ограничению распространения A. fruticosa .
Наконец, в этом исследовании мы обнаружили аналогичный генетический пул с восточного и западного берегов реки Нестос, который, вероятно, происходит из Болгарии. Будущие исследования должны также включать генетический анализ этих болгарских популяций. Считается необходимым продолжить исследования и изучение A. fruticosa в ближайшие годы, чтобы было более полное знание этого вида и его влияния на экосистему, чтобы затем можно было создать и создать систему управления этим видом. его преимущества можно использовать, не оказывая негативного воздействия на экосистему.

5. Выводы

Первое сообщение о генетическом разнообразии и распространении чужеродного вида Amorpha fruticosa L. было впервые использовано за рекой Нестос в Греции. Мы изучили две популяции, одну с западной стороны и одну с восточной стороны, с маркерами AFLP, и не обнаружили дифференциации между ними. Это указывает на то, что, вероятно, один генетический пул был передан через реку из Болгарии, и будущие исследования должны также охватывать болгарские популяции. Кроме того, проведенная первая оценка состояния регенерации также указывает на расширение вида. Это обязательный шаг для оценки и предложения мер управления с целью сохранения и ограничения распространения вида, который оказывает существенное негативное воздействие на среду обитания 91E0*.

Вклад автора

Концептуализация, EVA и EK; методология, EVA, EK, EM, ADS, GM и ГК; программное обеспечение, EVA, EM и EK; проверка, все; ресурсы, EVA и EK; курирование данных, EVA и EK; письмо — подготовка оригинального проекта, EVA, EK, EM и ADS; написание — просмотр и редактирование, все; надзор, EVA и EK; администрация проекта, ЭК; приобретение финансирования, Е.К. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Это исследование финансировалось проектом LIFE PRIMED, LIFE17 NAT/GR/000511, который софинансируется Греческим зеленым фондом (GRFU).

Заявление о доступности данных

Данные недоступны.

Конфликт интересов

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Рекомендации

  1. Ричардсон, DM; Пышек, П.; Рейманек, М.; Барбур, Миннесота; Панетта, Флорида; Уэст, К.Дж. Натурализация и вторжение чужеродных растений: концепции и определения. Дайверы. Распредел. 2000 , 6 , 93–107. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  2. Коракаки, ​​Э.; Легакис, А.; Кацаневакис, С.; Кулелис, П.; Аврамиду, Э.; Сулиоти, Н.; Петракис, П. Инвазивные чужеродные виды Греции. Обсервация инвазивных чужеродных видов. Проблемы вокруг света 2021 , 3 , 124–189. [ Академика Google ]
  3. Мияваки, С.; Вашитани, И. Инвазивные чужеродные виды растений в прибрежных районах Японии: вклад сельскохозяйственных сорняков, видов восстановления растительности и аквакультурных видов. Глоб. Окружающая среда. Рез.-англ. Эд. 2004 , 8 , 89–101. [ Академика Google ]
  4. Каллауэй, РМ; Ашехуг, Э.Т. Инвазивные растения против их новых и старых соседей: механизм экзотического вторжения. Наука 2000 , 290 , 521–523. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  5. Иванеску, Б.; Лунгу, К.; Власе, Л.; Градинару, AC; Тухилус, К. ВЭЖХ-анализ фенольных соединений, антиоксидантной и противомикробной активности Amorpha fruticosa L. Экстракты. Дж. Плант Дев. 2019 , 26 , 77. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  6. Штрауб, Южная Каролина; Извините, бакалавр; Уикли, А.С. Amorpha confusa , новое название старой Amorpha (Fabaceae: Amorpheae). Дж. Бот. Рез. Инст. Техас, 2009 г. , 151–155. [ Академика Google ]
  7. Штрауб, Южная Каролина; Дойл, Дж. Дж. Молекулярная филогенетика Amorpha (Fabaceae): оценка монофилии, видовых отношений и полиплоидного происхождения. Мол. Филогенетика Эвол. 2014 , 76 , 49–66. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  8. Лю, Дж.; Ван, ET; Chen, WX Разнообразные ризобии, связанные с древесными бобовыми культурами Wisteria sinensis , Cercis Racemosa и Amorpha fruticosa, выращиваемыми в умеренной зоне Китая. Сист. Прил. Микробиол. 2005 , 28 , 465–477. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  9. Китайский, П. Словарь китайской Materia Medica ; Китайская научно-техническая медицинская пресса: Пекин, Китай, 1997. [ Google Scholar ]
  10. Митчер, Луизиана; Парк, Ю.Х.; Альшамма, А.; Хадсон, ПБ; Хаас, Т. Аморфрутин a и b, бибензиловые противомикробные средства из Amorpha fruticosa . Фитохимия 1981 , 20 , 781–785. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  11. Крпан, АП; Томашич, Ж.; Башич Палкович, П. Биопотенциал индигобуша ( Amorpha fruticosa L.) – второй год исследования. Список Шумарского. 2011 , 135 , 103–112. [ Академика Google ]
  12. Кожухарова Е.; Матковский, А.; Возняк, Д.; Симеонова Р.; Найчов З.; Малайнер, К.; Мокан, А.; Набави, С.М.; Атанасов А.Г. Amorpha fruticosa – вредоносное инвазионное чужеродное растение в Европе или лекарственное растение от болезней обмена веществ? Передний. Фармакол. 2017 , 8 , 333. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  13. Сигетвари, К. Первые шаги по восстановлению пойменного луга после десятилетия доминирования инвазивного кустарника-трансформера Amorpha fruticosa L. Tiscia 2002 , 33 , 67–77. [ Академика Google ]
  14. Педашенко, Л.П.; Апостолова, И.И.; Васильев К.В. Невселенность Amorpha fruticosa в различных местообитаниях нижнего Дуная. Фитол. Балк. 2012 , 18 , 285–291. [ Академика Google ]
  15. Ариануцу, М.; Базос, И.; Делипетру, П.; Коккорис, Ю. Инопланетная флора Греции: таксономия, особенности жизни и предпочтения среды обитания. Биол. Вторжения 2010 , 12 , 3525–3549. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  16. Самарас, АГ; Коутитас, К.Г. Моделирование воздействия на прибрежную морфологию управления водными ресурсами в трансграничных речных бассейнах: пример реки Нестос. Менеджер. Окружающая среда. Квал. Межд. Дж. 2008 , 19 , 455–466. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  17. Декамп, Х.; Декамп, О. Средиземноморские прибрежные леса ; Сохранение водно-болотных угодий Средиземноморья; Тур дю Валат: Арль, Франция, 2001 г. [ Google Scholar ]
  18. Маллинис, Г.; Эмманолудис, Д.; Яннакопулос, В.; Марис, Ф.; Куциас, Н. Картирование и интерпретация исторических изменений растительного покрова/землепользования на участке «Натура 2000» с использованием данных наблюдений за Землей: пример дельты Нестоса, Греция. Прил. геогр. 2011 , 31 , 312–320. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  19. Дафис, С.; Папастергиаду, Э.; Георгиу, К.; Бабалонас, Д.; Георгиадис, Т.; Папагеоргиу, М.; Лазариду, Т.; Циаусси, В. Греческий проект «среды обитания» Natura 2000: Обзор. Пожизненный контракт B4-32000/94/756 ; Комиссия Европейских Сообществ, Музей естественной истории Гуландриса, Центр греческих биотопов и водно-болотных угодий; Springer: Берлин/Гейдельберг, Германия, 1996. [ Google Scholar ]
  20. Бьянки, Л.; Пачи, М. Эволюционная динамика и тосканское обучение: Sintesi di quarant'anni di richerche. Для.-Ж. Сильвик. Для. Экол. 2008 , 5 , 122. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
  21. Векеманс, X.; Боуэнс, Т.; Лемэр, М.; Ролдан-Руис, И. Данные маркеров амплифицированного полиморфизма длин фрагментов (AFLP) указывают на гомоплазию по размеру и взаимосвязь между степенью гомоплазии и размером фрагмента. Мол. Экол. 2002 , 11 , 139–151. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  22. Пикалл, РОД; Смаус, ЧП Genalex 6: Генетический анализ в Excel. Программное обеспечение популяционной генетики для обучения и исследований. Мол. Экол. Примечания 2006 , 6 , 288–295. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  23. Тафтсоглу, М.; Валканиотис, С.; Папатанасиу, Г.; Климис, Н.; Докас, И. Подробная карта подверженности разжижению дельты реки Нестос, Фракия, Греция, основанная на поверхностной геологии и геоморфологии. Geosciences 2022 , 12 , 361. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  24. ДеХаан, Л.; Эльке, Н.; Шиффер, К.; Вайз, Д.; ДеХаан, Р. Оценка разнообразия североамериканских образцов ложного индиго ( Amorpha fruticosa L.) для корма и биомассы. Жене. Ресурс. Кроп Эвол. 2006 , 53 , 1463–1476. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  25. Ли, М.; Лю, З.; Лю, К.; Чжу, Ф.; Ван, К.; Ван, З.; Ли, Х.; Лан, X.; Гуан, К. Засухоустойчивость табака, сверхэкспрессирующего ген afnac1 Amorpha fruticosa Linn. Передний. Наука о растениях. 2022 , 13 , 980171. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  26. Дат, Северная Каролина; Ли, Дж.-Х.; Лук-порей.; Хонг, Ю.-С.; Ким, Ю.Х.; Ли, Дж. Дж. Фенольные компоненты Amorpha fruticosa , которые ингибируют активацию nf-κb и связанную с ней экспрессию генов. Дж. Нэт. Прод. 2008 , 71 , 1696–1700. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  27. Песня, Ф.; Ци, Д.; Лю, X.; Конг, X.; Гао, Ю.; Чжоу, З.; Ву, К. Протеомный анализ симбиотических белков Glomus mosseae и Amorpha fruticosa . наук. Rep. 2015 , 5 , 18031. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  28. Тодорова Т.; Бояджиев, К.; Шкондров А.; Пырванова П.; Димитрова, М.; Ионкова И.; Крастева И.; Кожухарова Е.; Чанкова, С. Скрининг экстрактов Amorpha fruticosa и Ailanthus altissima на генотоксичность/антигенотоксичность, мутагенность/антимутагенность и канцерогенность/антиканцерогенность. БиоРиск 2022 , 17 , 201–212. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  29. Цветкович, Д.М.; Йованкич, СП; Милутинович, М.Г.; Никодиевич, Д.Д.; Грбович, Ф.Дж.; Чирич, АР; Топузович, доктор медицинских наук; Маркович, С.Д. Противоинвазивная активность Robinia pseudoacacia L. и Amorpha fruticosa L. На клеточной линии рака молочной железы mda-mb-231. Биология 2019 , 74 , 915–928. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
Чужеродные и инвазивные растения угрожают целостности природных экосистем, поскольку большинство из них являются инвазивными, конкурируют с местными растениями и во многих случаях занимают их место в экосистеме. Инвазивные виды характеризуются быстрым распространением за счет производства большого количества потомства, которое может рассеиваться на большие расстояния [ 1 ]. Более того, они имеют высокую выживаемость благодаря своей пластичности, способной реагировать на различные условия окружающей среды. Кроме того, некоторые природные явления могут способствовать их распространению, например, наводнения, ветер, поверхностная эрозия и т. д.
На распространение инвазивных видов также существенно повлияла деятельность человека [ 2 ]. С древних времен чужеродные растения случайно или намеренно переносились в новые места обитания и культивировались как садовые или декоративные растения [ 3 ]. Их распространению способствует также деятельность человека, роль которой двоякая: транспортировка размножающегося материала и изменение среды обитания. Главное преимущество заключается в том, что у них нет физических врагов, которые бы контролировали их население, чтобы они в полной мере использовали свой конкурентный потенциал. Некоторые инвазивные растения также развивают новые механизмы взаимодействия с природными экосистемами [ 4 ]. Одним из таких механизмов является продукция аллелопатических веществ и их выброс в экосистему [ 5].
Amorpha L. ( Fabaceae Juss.: Amorpheae Britains .) — род из 16 видов, произрастающих в Северной Америке [ 6 ]. Эти растения могут представлять собой кустарники, полукустарники или травянистые многолетние растения и встречаются в различных средах обитания, включая прибрежные коридоры, саванны и луга. Многие виды Amorpha имеют очень ограниченное распространение, а некоторые считаются находящимися под угрозой исчезновения [ 7 ].
Amorpha fruticosa L. (куст индиго) — многолетний листопадный кустарник, принадлежащий к семейству Fabaceae и произрастающий в юго-западной части Северной Америки [ 8 ]. Куст индиго был завезен в Европу как декоративное растение [ 5 ]. Его используют как лекарство для лечения ожогов и экземы [ 9 ]. В последние годы ему уделяется особое внимание из-за его биологической активности. Исследования показали, что это растение богато полифенолами и содержит биологически активные ингредиенты. Он также обладает противораковой, противовоспалительной и противомикробной активностью [ 10] .]. Куст индиго – растение, имеющее большую декоративную ценность и используемое при обустройстве городских ландшафтов и при охране склонов. Он может выжить в сухих почвах, но предпочитает берега рек и опушки затопленных лесов, где легко распространяется водой, поскольку его семенные коробочки плавучие [11 ] . Его высокая толерантность к различным климатическим условиям, а также отличная способность к размножению дают ему возможность с легкостью расти за пределами своего естественного распространения [ 12 ]. Сегодня он признан одним из наиболее инвазивных видов в Европе, оказывающим серьезное воздействие на местные экосистемы [ 11 ]. Это светолюбивое растение, конкурирующее за свет, образующее густые заросли, затмевающие местную флору, а это приводит к снижению биоразнообразия [ 11, 12 , 13 ]. Из-за ущерба, который он наносит природным экосистемам и водному хозяйству, следует немедленно принять меры по сокращению/контролю его популяции.
В Греции трансграничные реки, такие как Нестос, Аксиос и др., являются транспортными коридорами для чужеродных видов растений, которые расширяют свой ареал за счет воды [ 14 ]. Однако, помимо конкретного вида транспорта, в последние годы в Грецию были интродуцированы многие зарубежные виды растений, как намеренно (например, декоративные и лекарственные растения), так и непреднамеренно, используя различные способы интродукции [2 ] . Хотя число чужеродных видов велико, не все из них являются инвазивными. Из 343 чужеродных видов только 50 проявляют инвазионное поведение, и большинство из них имеют американское происхождение [ 15 ].
Нестос — трансграничная река Болгарии и Северной Греции. Берет начало от горы Рила на юге Болгарии и проходит между горными хребтами Аймос и Родопы. Его длина составляет 234 км, из них 130 км находится на территории Греции [ 16 ]. Прежде чем впасть в море, он простирается через равнину Хрисуполис и расширяется как дельтовая система с пресноводными озерами, образующими дельту Нестоса. В этой зоне существует приоритетная среда обитания 91E0 (Приложение I Директивы 92/43/EEC), в которой представлены два подтипа: подтип ольховых насаждений ( Alnus Glutinosa ) и подтип тополя белого ( Populus alba ) и вяза ( Ulmusminor ).) стоит. Первый подтип состоит из чистых насаждений ольхи, произрастающих на легких и умеренно легких почвах с очень хорошими физическими свойствами, которые можно охарактеризовать как Calcaric fluvisols. При этом уровень грунтовых вод относительно высокий (90–95 см). Этот подтип встречается между дамбами, местами вблизи берегов рек или в местах, удаленных от них на несколько десятков метров. Второй подтип составляет значительную часть тугайного леса и располагается за пределами дамб. Он состоит из насаждений белого тополя и вяза, которые растут на глубоких и умеренно легких почвах с хорошими физическими свойствами, принадлежащих к типу почв Eutric Fluvisol, без проблем с щелочностью и засоленностью. Уровень грунтовых вод низкий, но сильно колеблется [ 17 ].
Территория вдоль реки существенно изменилась со времен Второй мировой войны [ 18 ]. В 1945 году на этой территории преобладали леса и водно-болотные угодья. В 1960-е годы площадь сельскохозяйственных угодий увеличилась, что привело к уменьшению лесных площадей. Также произошло значительное сокращение площади водно-болотных угодий из-за их преобразования в пастбища. Однако, несмотря на сильное упадок природной экосистемы, в этом районе по-прежнему сохраняется самый обширный речной лес в Греции. Кроме того, равнина реки Нестос имеет важное экологическое значение из-за множества важных мест обитания. Он был классифицирован как водно-болотное угодье международного значения и включен в Рамсарскую конвенцию. Он также защищен Бернской конвенцией, директивами Европейской комиссии и законодательством Греции. Кроме того, он принадлежит к сети Natura 2000.19 ].
В Греции Amorpha fruticosa L. считается инвазивным видом, поскольку это растение способно распространяться на обширной территории. В настоящей работе изучено генетическое разнообразие популяций Amorpha fruticosa L., произрастающих вдоль реки Нестос. Наши цели заключались в том, чтобы (1) определить уровень генетической дифференциации, если она существует, между двумя берегами реки: западным и восточным; (2) оценить степень инбридинга в каждой популяции, а также эффективный размер популяции; и (3) обсудить последствия расширения конкретных видов в естественной экосистеме и, более конкретно, в популяциях местных видов в этом районе.

2. Материалы и методы

2.1. Растительный материал

Сбор образцов листьев проведен на 20 особях Amorpha fruticosa из 2 популяций района реки Нестос (ориентировочные координаты западной популяции A: X: 565671, Y: 4527927 и восточной популяции: X: 566918, Y: 4525481). Экстракцию ДНК из свежей хвои проводили с помощью набора Macherey Nagel Plant (Düren, Северный Рейн-Вестфалия, Германия) в соответствии с протоколом производителя.

2.2. Процедура ПФЛП

Всего 200 нг геномной ДНК фрагментировали расщеплением 4 ед. ферментов EcoRI и MseI при температуре 37°С в течение 3 часов. Расщепленные фрагменты ДНК затем объединяли с адаптерами EcoRI и MseI и полученную смесь лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 от New England Biolabs (Ипсвич, Массачусетс, США). Этот этап лигирования проводили при температуре 26°C в течение 3 часов. Полученную в результате этого процесса ДНК использовали в качестве первичной матрицы для анализа AFLP.
Для этапа преамплификации использовали пару праймеров на основе последовательностей адаптеров EcoRI и MseI с дополнительным селективным нуклеотидом на 3'-конце (EcoRI+A и MseI+C). ПЦР с предварительной амплификацией проводили в общем объеме 20 мкл, который содержал 1X буфер Kapa Taq, 0,2 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl 2., 30 нг каждого праймера (EcoRI+A и MseI+C), 1 единица ДНК-полимеразы Taq от Kapa Biosystems (расположена в Уилмингтоне, Массачусетс, США) и 5 ​​мкл разведенных фрагментов ДНК, полученных в результате реакции расщепления и лигирования. . Условия циклирования ПЦР были следующими: начальная денатурация при 95 °С в течение 30 с, затем 32 цикла денатурации при 95 °С в течение 30 с, отжиг при 56 °С в течение 30 с, удлинение при 72 °С в течение 1 мин. и заключительный этап удлинения при 72 ° C в течение 10 минут. Для подтверждения амплификации образец реакции объемом 5 мкл подвергали электрофорезу в агарозном геле, а оставшиеся 15 мкл разбавляли в 5 раз ТЕ-буфером.
Селективную амплификацию проводили в реакционных объемах объемом 10 мкл, состоящих из 3 мкл разбавленной преселективной матрицы, и с использованием тех же условий реакции, что и на стадии преселективной амплификации, за исключением использования 30 нг праймера MseI и 5 нг праймера EcoRI. за реакцию. Программа циклической селективной амплификации осуществлялась с использованием термоциклера BioRad (Hercules, Калифорния, США) по следующей схеме: начальный цикл денатурации при 95 °C в течение 30 с, отжиг при 65 °C в течение 30 с и удлинение при 95 °C в течение 30 с. 72 °С в течение 1 мин. За этим следовали двенадцать циклов денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг, начинающийся при 65°С в течение 30 с и уменьшающийся на 0,75°С в каждом цикле, и удлинение при 72°С в течение 1 мин. Наконец, двадцать три цикла денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг при 56°С в течение 30 с,
Смеси продуктов f-AFLP подвергали денатурации путем обработки их формамидом при температуре 94 °С в течение 2 мин. Впоследствии эти денатурированные смеси разделяли электрофорезом с использованием генетического анализатора ABI Prism 3730xl, который производится Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Использовали десять комбинаций селективных праймеров AFLP. Затем каждый отдельный гибрид исследовали для определения наличия или отсутствия конкретных фрагментов. Размер обнаруженных фрагментов определяли с использованием программы GeneMapper 4.0 вместе с внутренним стандартом, известным как GS 500 LIZ, который также был предоставлен Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров,20 ].

2.3. Индекс регенерации

Присутствие и плотность A. fruticosa оценивались в приоритетном местообитании 91E0* в районе Нестос на северо-востоке Греции ( рис. 1 ). Пятнадцать (15) участков, каждый площадью 706,86 м 2 , были выбраны случайным образом и равномерно размещены по всей территории обитания 91E0*. В дальнейшем был проведен анализ состава и структуры древесных пород на этих участках. A. fruticosa присутствовала на четырех участках из 15, из которых три располагались на западном берегу реки и один на восточном. У особей A. fruticosa измеряли высоту дерева (м), плотность (особей га -1 ) и индекс регенерации (IR) . IR рассчитывали путем умножения плотности A. fruticosa (на м2 ) по средней высоте A. fruticosa (см) и позволяет оценить степень регенерации [ 20 ].
Экология 04 00041 g001
Рисунок 1. Amorpha fruticosa , распространенная на приоритетном местообитании 91Ε0* в дельте Нестоса, на северо-востоке Греции.

2.4. Сбор данных и статистический анализ данных AFLP

Для преобразования информации о размере аллелей, полученной с помощью GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems, США), в двоичный формат использовался макрос AFLP Excel. Этот макрос присваивал значение «1» присутствующим фрагментам и «0» отсутствующим. Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров, подсчитывали и подвергали дополнительному изучению только согласованные фрагменты, попадающие в диапазон от 150 до 500 пар оснований [ 21 ]. Кроме того, GenAlex v6.0 [ 22 ] использовался для расчета таких параметров, как процент полиморфных полос (P), информационный индекс Шеннона (I) и генетическое разнообразие (He). GenAlex v6.0 также использовался для проведения анализа молекулярной дисперсии (AMOVA), а также для расчета генетических расстояний и анализа главных координат (PCoA).
Подробно, анализ главных координат (PCoA) представляет собой многомерный метод, который позволяет находить и отображать основные закономерности в многомерном наборе данных (например, множественных локусах и множественных образцах). Математика сложна, но, по сути, PCoA — это процесс, с помощью которого основные оси вариаций располагаются в многомерном наборе данных. Для многомерных наборов данных каждая последующая ось объясняет пропорционально меньшую часть общей вариации, так что при наличии отдельных групп первые две или три оси обычно выявляют большую часть разделения между ними. Предусмотрено четыре различных варианта: два основаны на преобразовании матрицы расстояний в ковариационную матрицу, а два работают непосредственно на основе входной матрицы расстояний. Матрица расстояний используется как пул для расчета распределения по осям [22 ].

2.5. Информация о среде обитания 91E0*

Местообитание 91E0* в дельте реки Нестос простирается на небольших высотах (<100 м над уровнем моря) с поверхностями от умеренного до плоского рельефа (уклон 0–10%) (выборка личных данных Коракаки Э. и Карецоса Г.). В его состав входят доминирующие виды деревьев, такие как Fraxinus excelsior L. и Alnus Glutinosa (L.) Gaertn., а также Fraxinus angustifolia Vahl, Salix alba L., Populus alba L., Pinus nigra JF Arnold, Juglans regia L., Cornus sanguinea. L., Ulmus major Mill. и Quercus robur subsp. pedunculiflora (К. Кох) Меницкого. Существует множество вьющихся растений (например,Periploca graeca L. и др.), а травянистый ярус неизменно включает множество видов (например, Aegopodium podagraria L., Hedera helix L., Lysimachia punctata L., Circaea lutetiana L., Arum maculatum L. и др.) (Solomou Выборка персональных данных А. и Карецоса Г.). Дельта Нестоса образована аллювиальными отложениями реки Нестос. Речные отложения состоят из аллювиальных отложений глин, песков и гравия, тогда как пойменные отложения состоят преимущественно из глин и песков [ 23 ].

3. Результаты

3.1. Генетические результаты

Семь комбинаций праймеров AFLP дали 313 локусов для двух популяций. По результатам AFLP, восточная популяция имела полиморфизм 83,39%, а западная — 83,07%. Средняя ожидаемая гетерозиготность (He) составляла 0,127, а западная популяция имела среднюю гетерозиготность немного выше (0,136), чем восточная (0,119). Параметры генетического разнообразия представлены в Таблице 1 вместе с эпигенетическими результатами.
Таблица 1. Среднее значение и стандартная ошибка (SE) для Na (количество аллелей), Ne (количество эффективных аллелей), I (информационный индекс Шеннона) и He (ожидаемая гетерозиготность).
AMOVA (анализ молекулярной дисперсии) определил 97% генетических вариаций внутри популяций и 3% только между популяциями ( рис. 2 ). Анализ основных координат объяснил 16,89% дисперсии ( рис. 3 ).
Экология 04 00041 g002
Рисунок 2. Анализ молекулярной дисперсии среди популяций и внутри них: дисперсия среди популяций составила 3%, а внутри - 97%. Генетическая вариация фрагментов AFLP, использованных для анализа AMOVA.
Экология 04 00041 g003
Рисунок 3. Анализ основных координат объяснил 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы в зависимости от происхождения популяций. На рисунке обозначена небольшая группировка двух популяций, полученная на основе матрицы генетических расстояний генотипов.

3.2. Плотность и индекс регенерации

На четырех участках было зарегистрировано в общей сложности 233 особи A. fruticosa , в результате чего средняя плотность составила 824,07 растений на гектар. Примечательно, что плотность A. fruticosa и индекс регенерации (IR) оказались выше у популяции, проживающей на западном берегу реки, по сравнению с восточным берегом реки. Однако стоит отметить, что средняя высота деревьев была выше на восточном берегу реки, как указано в Таблице 2 . В аллювиальном лесу наиболее широко распространено возобновление чужеродных видов A. fruticosa и A. negundo (личное сообщение Коракаки).
Таблица 2. Средняя высота, средняя плотность и средний индекс регенерации (IR).

4. Дискуссия

Сообщается, что ложное индиго ( Amorpha fruticosa L.) является неместным [ 15 ], и недавние наблюдения зафиксировали его присутствие на значительных территориях вдоль рек Ардас, Эврос и Нестос на северо-востоке Греции, что указывает на его завоз из соседней Болгарии. , возможно, через речной транспорт генетического материала. В прибрежных лесах реки Нестос на северо-востоке Греции A. fruticosa демонстрирует значительную динамику регенерации и, по-видимому, подавляет растительность в важных приоритетных местообитаниях.
В этом исследовании мы оценили генетическое разнообразие двух популяций с западного и восточного берегов реки Нестос, чтобы оценить, имеют ли они различия в генетических параметрах или имеют ли они схожие индексы генетического разнообразия. По оценкам локусов AFLP, гетерозиготность западной популяции была немного выше, но существенно не отличалась от восточной популяции. Более того, как показал анализ AMOVA, большая часть генетических вариаций наблюдалась внутри популяций (97%). Анализ основных координат объяснил лишь 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы по происхождению популяций. Главный вывод генетического анализа заключался в том, что западные и восточные популяции имеют общий генетический фонд, который поступает с водой через реку Нестос.
Что касается аналогичных исследований, авторы не обнаружили никаких упоминаний о генетическом разнообразии с использованием молекулярных маркеров растений A. fruticosa . Однако есть одно исследование [ 24 ], в котором они измерили 47 агрономических и морфологических признаков энергии биомассы. Результаты показали, что на все признаки повлияли образцы, и это ключ, который также может демонстрировать генетическое содержание, которое, вероятно, влияет на изменчивость. Кроме того, были проведены исследования экспрессии генов, связанных с засухой [ 25 ], фенольных компонентов [ 26 ], протеомного анализа симбиотических белков [ 27 ] и исследований рака [ 28 , 29] .]. Вышеупомянутые исследования с одной точки зрения указывают на значение A. fruticosa , хотя мы не можем исключить негативное воздействие, которое он оказывает на экосистемы из-за его быстрого распространения. Этот инвазивный вид может проникнуть в луговые сообщества и быстро превратить среду обитания в густые и однородные заросли. Он вытесняет местные растения и нарушает естественную сукцессию растений и биоразнообразие. Это представляет собой серьезную угрозу, поскольку подавляет местные виды деревьев в приоритетном аллювиальном лесу дельты Нестоса (91E0*). Кроме того, это ставит под угрозу выживание видов Emys orbcularis , Testudo Hermanni и Callimorpha Quadripunctaria *, поскольку они зависят от этих мест обитания.
Согласно нашим выводам, A. fruticosa более активно развивается на западном берегу реки Нестос, что представляет значительный риск для биоразнообразия и подавления местных видов деревьев в аллювиальных лесах региона Нестос. Таким образом, любые природоохранные меры и действия по управлению лесами, направленные на ограничение распространения A. fruticosa , должны быть приоритетными на этом берегу реки. Меры по сохранению необходимы для защиты и поддержания этой естественной среды обитания, которая представляет значительный интерес для сообщества. Действия также должны быть направлены на повышение осведомленности об угрозах, с которыми сталкиваются аллювиальные леса, и на обеспечение их долгосрочной защиты и сохранения. Этот результат ИК дает нам первое указание на то, что A. fruticosaбудет более обширным на западной стороне, и результат небольшой, но более высокой гетерозиготности согласуется с текущим результатом. С 2021 года Институт средиземноморских лесных экосистем (ELGO-DIMITRA) разрабатывает различные экспериментальные методы лечения, чтобы изучить возможные решения по ограничению распространения A. fruticosa .
Наконец, в этом исследовании мы обнаружили аналогичный генетический пул с восточного и западного берегов реки Нестос, который, вероятно, происходит из Болгарии. Будущие исследования должны также включать генетический анализ этих болгарских популяций. Считается необходимым продолжить исследования и изучение A. fruticosa в ближайшие годы, чтобы было более полное знание этого вида и его влияния на экосистему, чтобы затем можно было создать и создать систему управления этим видом. его преимущества можно использовать, не оказывая негативного воздействия на экосистему.

5. Выводы

Первое сообщение о генетическом разнообразии и распространении чужеродного вида Amorpha fruticosa L. было впервые использовано за рекой Нестос в Греции. Мы изучили две популяции, одну с западной стороны и одну с восточной стороны, с маркерами AFLP, и не обнаружили дифференциации между ними. Это указывает на то, что, вероятно, один генетический пул был передан через реку из Болгарии, и будущие исследования должны также охватывать болгарские популяции. Кроме того, проведенная первая оценка состояния регенерации также указывает на расширение вида. Это обязательный шаг для оценки и предложения мер управления с целью сохранения и ограничения распространения вида, который оказывает существенное негативное воздействие на среду обитания 91E0*.

Вклад автора

Концептуализация, EVA и EK; методология, EVA, EK, EM, ADS, GM и ГК; программное обеспечение, EVA, EM и EK; проверка, все; ресурсы, EVA и EK; курирование данных, EVA и EK; письмо — подготовка оригинального проекта, EVA, EK, EM и ADS; написание — просмотр и редактирование, все; надзор, EVA и EK; администрация проекта, ЭК; приобретение финансирования, Е.К. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Это исследование финансировалось проектом LIFE PRIMED, LIFE17 NAT/GR/000511, который софинансируется Греческим зеленым фондом (GRFU).

Заявление о доступности данных

Данные недоступны.

Конфликт интересов

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Рекомендации

  1. Ричардсон, DM; Пышек, П.; Рейманек, М.; Барбур, Миннесота; Панетта, Флорида; Уэст, К.Дж. Натурализация и вторжение чужеродных растений: концепции и определения. Дайверы. Распредел. 2000 , 6 , 93–107. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  2. Коракаки, ​​Э.; Легакис, А.; Кацаневакис, С.; Кулелис, П.; Аврамиду, Э.; Сулиоти, Н.; Петракис, П. Инвазивные чужеродные виды Греции. Обсервация инвазивных чужеродных видов. Проблемы вокруг света 2021 , 3 , 124–189. [ Академика Google ]
  3. Мияваки, С.; Вашитани, И. Инвазивные чужеродные виды растений в прибрежных районах Японии: вклад сельскохозяйственных сорняков, видов восстановления растительности и аквакультурных видов. Глоб. Окружающая среда. Рез.-англ. Эд. 2004 , 8 , 89–101. [ Академика Google ]
  4. Каллауэй, РМ; Ашехуг, Э.Т. Инвазивные растения против их новых и старых соседей: механизм экзотического вторжения. Наука 2000 , 290 , 521–523. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  5. Иванеску, Б.; Лунгу, К.; Власе, Л.; Градинару, AC; Тухилус, К. ВЭЖХ-анализ фенольных соединений, антиоксидантной и противомикробной активности Amorpha fruticosa L. Экстракты. Дж. Плант Дев. 2019 , 26 , 77. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  6. Штрауб, Южная Каролина; Извините, бакалавр; Уикли, А.С. Amorpha confusa , новое название старой Amorpha (Fabaceae: Amorpheae). Дж. Бот. Рез. Инст. Техас, 2009 г. , 151–155. [ Академика Google ]
  7. Штрауб, Южная Каролина; Дойл, Дж. Дж. Молекулярная филогенетика Amorpha (Fabaceae): оценка монофилии, видовых отношений и полиплоидного происхождения. Мол. Филогенетика Эвол. 2014 , 76 , 49–66. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  8. Лю, Дж.; Ван, ET; Chen, WX Разнообразные ризобии, связанные с древесными бобовыми культурами Wisteria sinensis , Cercis Racemosa и Amorpha fruticosa, выращиваемыми в умеренной зоне Китая. Сист. Прил. Микробиол. 2005 , 28 , 465–477. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  9. Китайский, П. Словарь китайской Materia Medica ; Китайская научно-техническая медицинская пресса: Пекин, Китай, 1997. [ Google Scholar ]
  10. Митчер, Луизиана; Парк, Ю.Х.; Альшамма, А.; Хадсон, ПБ; Хаас, Т. Аморфрутин a и b, бибензиловые противомикробные средства из Amorpha fruticosa . Фитохимия 1981 , 20 , 781–785. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  11. Крпан, АП; Томашич, Ж.; Башич Палкович, П. Биопотенциал индигобуша ( Amorpha fruticosa L.) – второй год исследования. Список Шумарского. 2011 , 135 , 103–112. [ Академика Google ]
  12. Кожухарова Е.; Матковский, А.; Возняк, Д.; Симеонова Р.; Найчов З.; Малайнер, К.; Мокан, А.; Набави, С.М.; Атанасов А.Г. Amorpha fruticosa – вредоносное инвазионное чужеродное растение в Европе или лекарственное растение от болезней обмена веществ? Передний. Фармакол. 2017 , 8 , 333. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  13. Сигетвари, К. Первые шаги по восстановлению пойменного луга после десятилетия доминирования инвазивного кустарника-трансформера Amorpha fruticosa L. Tiscia 2002 , 33 , 67–77. [ Академика Google ]
  14. Педашенко, Л.П.; Апостолова, И.И.; Васильев К.В. Невселенность Amorpha fruticosa в различных местообитаниях нижнего Дуная. Фитол. Балк. 2012 , 18 , 285–291. [ Академика Google ]
  15. Ариануцу, М.; Базос, И.; Делипетру, П.; Коккорис, Ю. Инопланетная флора Греции: таксономия, особенности жизни и предпочтения среды обитания. Биол. Вторжения 2010 , 12 , 3525–3549. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  16. Самарас, АГ; Коутитас, К.Г. Моделирование воздействия на прибрежную морфологию управления водными ресурсами в трансграничных речных бассейнах: пример реки Нестос. Менеджер. Окружающая среда. Квал. Межд. Дж. 2008 , 19 , 455–466. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  17. Декамп, Х.; Декамп, О. Средиземноморские прибрежные леса ; Сохранение водно-болотных угодий Средиземноморья; Тур дю Валат: Арль, Франция, 2001 г. [ Google Scholar ]
  18. Маллинис, Г.; Эмманолудис, Д.; Яннакопулос, В.; Марис, Ф.; Куциас, Н. Картирование и интерпретация исторических изменений растительного покрова/землепользования на участке «Натура 2000» с использованием данных наблюдений за Землей: пример дельты Нестоса, Греция. Прил. геогр. 2011 , 31 , 312–320. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  19. Дафис, С.; Папастергиаду, Э.; Георгиу, К.; Бабалонас, Д.; Георгиадис, Т.; Папагеоргиу, М.; Лазариду, Т.; Циаусси, В. Греческий проект «среды обитания» Natura 2000: Обзор. Пожизненный контракт B4-32000/94/756 ; Комиссия Европейских Сообществ, Музей естественной истории Гуландриса, Центр греческих биотопов и водно-болотных угодий; Springer: Берлин/Гейдельберг, Германия, 1996. [ Google Scholar ]
  20. Бьянки, Л.; Пачи, М. Эволюционная динамика и тосканское обучение: Sintesi di quarant'anni di richerche. Для.-Ж. Сильвик. Для. Экол. 2008 , 5 , 122. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
  21. Векеманс, X.; Боуэнс, Т.; Лемэр, М.; Ролдан-Руис, И. Данные маркеров амплифицированного полиморфизма длин фрагментов (AFLP) указывают на гомоплазию по размеру и взаимосвязь между степенью гомоплазии и размером фрагмента. Мол. Экол. 2002 , 11 , 139–151. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  22. Пикалл, РОД; Смаус, ЧП Genalex 6: Генетический анализ в Excel. Программное обеспечение популяционной генетики для обучения и исследований. Мол. Экол. Примечания 2006 , 6 , 288–295. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  23. Тафтсоглу, М.; Валканиотис, С.; Папатанасиу, Г.; Климис, Н.; Докас, И. Подробная карта подверженности разжижению дельты реки Нестос, Фракия, Греция, основанная на поверхностной геологии и геоморфологии. Geosciences 2022 , 12 , 361. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  24. ДеХаан, Л.; Эльке, Н.; Шиффер, К.; Вайз, Д.; ДеХаан, Р. Оценка разнообразия североамериканских образцов ложного индиго ( Amorpha fruticosa L.) для корма и биомассы. Жене. Ресурс. Кроп Эвол. 2006 , 53 , 1463–1476. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  25. Ли, М.; Лю, З.; Лю, К.; Чжу, Ф.; Ван, К.; Ван, З.; Ли, Х.; Лан, X.; Гуан, К. Засухоустойчивость табака, сверхэкспрессирующего ген afnac1 Amorpha fruticosa Linn. Передний. Наука о растениях. 2022 , 13 , 980171. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  26. Дат, Северная Каролина; Ли, Дж.-Х.; Лук-порей.; Хонг, Ю.-С.; Ким, Ю.Х.; Ли, Дж. Дж. Фенольные компоненты Amorpha fruticosa , которые ингибируют активацию nf-κb и связанную с ней экспрессию генов. Дж. Нэт. Прод. 2008 , 71 , 1696–1700. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  27. Песня, Ф.; Ци, Д.; Лю, X.; Конг, X.; Гао, Ю.; Чжоу, З.; Ву, К. Протеомный анализ симбиотических белков Glomus mosseae и Amorpha fruticosa . наук. Rep. 2015 , 5 , 18031. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  28. Тодорова Т.; Бояджиев, К.; Шкондров А.; Пырванова П.; Димитрова, М.; Ионкова И.; Крастева И.; Кожухарова Е.; Чанкова, С. Скрининг экстрактов Amorpha fruticosa и Ailanthus altissima на генотоксичность/антигенотоксичность, мутагенность/антимутагенность и канцерогенность/антиканцерогенность. БиоРиск 2022 , 17 , 201–212. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  29. Цветкович, Д.М.; Йованкич, СП; Милутинович, М.Г.; Никодиевич, Д.Д.; Грбович, Ф.Дж.; Чирич, АР; Топузович, доктор медицинских наук; Маркович, С.Д. Противоинвазивная активность Robinia pseudoacacia L. и Amorpha fruticosa L. На клеточной линии рака молочной железы mda-mb-231. Биология 2019 , 74 , 915–928. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
Чужеродные и инвазивные растения угрожают целостности природных экосистем, поскольку большинство из них являются инвазивными, конкурируют с местными растениями и во многих случаях занимают их место в экосистеме. Инвазивные виды характеризуются быстрым распространением за счет производства большого количества потомства, которое может рассеиваться на большие расстояния [ 1 ]. Более того, они имеют высокую выживаемость благодаря своей пластичности, способной реагировать на различные условия окружающей среды. Кроме того, некоторые природные явления могут способствовать их распространению, например, наводнения, ветер, поверхностная эрозия и т. д.
На распространение инвазивных видов также существенно повлияла деятельность человека [ 2 ]. С древних времен чужеродные растения случайно или намеренно переносились в новые места обитания и культивировались как садовые или декоративные растения [ 3 ]. Их распространению способствует также деятельность человека, роль которой двоякая: транспортировка размножающегося материала и изменение среды обитания. Главное преимущество заключается в том, что у них нет физических врагов, которые бы контролировали их население, чтобы они в полной мере использовали свой конкурентный потенциал. Некоторые инвазивные растения также развивают новые механизмы взаимодействия с природными экосистемами [ 4 ]. Одним из таких механизмов является продукция аллелопатических веществ и их выброс в экосистему [ 5].
Amorpha L. ( Fabaceae Juss.: Amorpheae Britains .) — род из 16 видов, произрастающих в Северной Америке [ 6 ]. Эти растения могут представлять собой кустарники, полукустарники или травянистые многолетние растения и встречаются в различных средах обитания, включая прибрежные коридоры, саванны и луга. Многие виды Amorpha имеют очень ограниченное распространение, а некоторые считаются находящимися под угрозой исчезновения [ 7 ].
Amorpha fruticosa L. (куст индиго) — многолетний листопадный кустарник, принадлежащий к семейству Fabaceae и произрастающий в юго-западной части Северной Америки [ 8 ]. Куст индиго был завезен в Европу как декоративное растение [ 5 ]. Его используют как лекарство для лечения ожогов и экземы [ 9 ]. В последние годы ему уделяется особое внимание из-за его биологической активности. Исследования показали, что это растение богато полифенолами и содержит биологически активные ингредиенты. Он также обладает противораковой, противовоспалительной и противомикробной активностью [ 10] .]. Куст индиго – растение, имеющее большую декоративную ценность и используемое при обустройстве городских ландшафтов и при охране склонов. Он может выжить в сухих почвах, но предпочитает берега рек и опушки затопленных лесов, где легко распространяется водой, поскольку его семенные коробочки плавучие [11 ] . Его высокая толерантность к различным климатическим условиям, а также отличная способность к размножению дают ему возможность с легкостью расти за пределами своего естественного распространения [ 12 ]. Сегодня он признан одним из наиболее инвазивных видов в Европе, оказывающим серьезное воздействие на местные экосистемы [ 11 ]. Это светолюбивое растение, конкурирующее за свет, образующее густые заросли, затмевающие местную флору, а это приводит к снижению биоразнообразия [ 11, 12 , 13 ]. Из-за ущерба, который он наносит природным экосистемам и водному хозяйству, следует немедленно принять меры по сокращению/контролю его популяции.
В Греции трансграничные реки, такие как Нестос, Аксиос и др., являются транспортными коридорами для чужеродных видов растений, которые расширяют свой ареал за счет воды [ 14 ]. Однако, помимо конкретного вида транспорта, в последние годы в Грецию были интродуцированы многие зарубежные виды растений, как намеренно (например, декоративные и лекарственные растения), так и непреднамеренно, используя различные способы интродукции [2 ] . Хотя число чужеродных видов велико, не все из них являются инвазивными. Из 343 чужеродных видов только 50 проявляют инвазионное поведение, и большинство из них имеют американское происхождение [ 15 ].
Нестос — трансграничная река Болгарии и Северной Греции. Берет начало от горы Рила на юге Болгарии и проходит между горными хребтами Аймос и Родопы. Его длина составляет 234 км, из них 130 км находится на территории Греции [ 16 ]. Прежде чем впасть в море, он простирается через равнину Хрисуполис и расширяется как дельтовая система с пресноводными озерами, образующими дельту Нестоса. В этой зоне существует приоритетная среда обитания 91E0 (Приложение I Директивы 92/43/EEC), в которой представлены два подтипа: подтип ольховых насаждений ( Alnus Glutinosa ) и подтип тополя белого ( Populus alba ) и вяза ( Ulmusminor ).) стоит. Первый подтип состоит из чистых насаждений ольхи, произрастающих на легких и умеренно легких почвах с очень хорошими физическими свойствами, которые можно охарактеризовать как Calcaric fluvisols. При этом уровень грунтовых вод относительно высокий (90–95 см). Этот подтип встречается между дамбами, местами вблизи берегов рек или в местах, удаленных от них на несколько десятков метров. Второй подтип составляет значительную часть тугайного леса и располагается за пределами дамб. Он состоит из насаждений белого тополя и вяза, которые растут на глубоких и умеренно легких почвах с хорошими физическими свойствами, принадлежащих к типу почв Eutric Fluvisol, без проблем с щелочностью и засоленностью. Уровень грунтовых вод низкий, но сильно колеблется [ 17 ].
Территория вдоль реки существенно изменилась со времен Второй мировой войны [ 18 ]. В 1945 году на этой территории преобладали леса и водно-болотные угодья. В 1960-е годы площадь сельскохозяйственных угодий увеличилась, что привело к уменьшению лесных площадей. Также произошло значительное сокращение площади водно-болотных угодий из-за их преобразования в пастбища. Однако, несмотря на сильное упадок природной экосистемы, в этом районе по-прежнему сохраняется самый обширный речной лес в Греции. Кроме того, равнина реки Нестос имеет важное экологическое значение из-за множества важных мест обитания. Он был классифицирован как водно-болотное угодье международного значения и включен в Рамсарскую конвенцию. Он также защищен Бернской конвенцией, директивами Европейской комиссии и законодательством Греции. Кроме того, он принадлежит к сети Natura 2000.19 ].
В Греции Amorpha fruticosa L. считается инвазивным видом, поскольку это растение способно распространяться на обширной территории. В настоящей работе изучено генетическое разнообразие популяций Amorpha fruticosa L., произрастающих вдоль реки Нестос. Наши цели заключались в том, чтобы (1) определить уровень генетической дифференциации, если она существует, между двумя берегами реки: западным и восточным; (2) оценить степень инбридинга в каждой популяции, а также эффективный размер популяции; и (3) обсудить последствия расширения конкретных видов в естественной экосистеме и, более конкретно, в популяциях местных видов в этом районе.

2. Материалы и методы

2.1. Растительный материал

Сбор образцов листьев проведен на 20 особях Amorpha fruticosa из 2 популяций района реки Нестос (ориентировочные координаты западной популяции A: X: 565671, Y: 4527927 и восточной популяции: X: 566918, Y: 4525481). Экстракцию ДНК из свежей хвои проводили с помощью набора Macherey Nagel Plant (Düren, Северный Рейн-Вестфалия, Германия) в соответствии с протоколом производителя.

2.2. Процедура ПФЛП

Всего 200 нг геномной ДНК фрагментировали расщеплением 4 ед. ферментов EcoRI и MseI при температуре 37°С в течение 3 часов. Расщепленные фрагменты ДНК затем объединяли с адаптерами EcoRI и MseI и полученную смесь лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 от New England Biolabs (Ипсвич, Массачусетс, США). Этот этап лигирования проводили при температуре 26°C в течение 3 часов. Полученную в результате этого процесса ДНК использовали в качестве первичной матрицы для анализа AFLP.
Для этапа преамплификации использовали пару праймеров на основе последовательностей адаптеров EcoRI и MseI с дополнительным селективным нуклеотидом на 3'-конце (EcoRI+A и MseI+C). ПЦР с предварительной амплификацией проводили в общем объеме 20 мкл, который содержал 1X буфер Kapa Taq, 0,2 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl 2., 30 нг каждого праймера (EcoRI+A и MseI+C), 1 единица ДНК-полимеразы Taq от Kapa Biosystems (расположена в Уилмингтоне, Массачусетс, США) и 5 ​​мкл разведенных фрагментов ДНК, полученных в результате реакции расщепления и лигирования. . Условия циклирования ПЦР были следующими: начальная денатурация при 95 °С в течение 30 с, затем 32 цикла денатурации при 95 °С в течение 30 с, отжиг при 56 °С в течение 30 с, удлинение при 72 °С в течение 1 мин. и заключительный этап удлинения при 72 ° C в течение 10 минут. Для подтверждения амплификации образец реакции объемом 5 мкл подвергали электрофорезу в агарозном геле, а оставшиеся 15 мкл разбавляли в 5 раз ТЕ-буфером.
Селективную амплификацию проводили в реакционных объемах объемом 10 мкл, состоящих из 3 мкл разбавленной преселективной матрицы, и с использованием тех же условий реакции, что и на стадии преселективной амплификации, за исключением использования 30 нг праймера MseI и 5 нг праймера EcoRI. за реакцию. Программа циклической селективной амплификации осуществлялась с использованием термоциклера BioRad (Hercules, Калифорния, США) по следующей схеме: начальный цикл денатурации при 95 °C в течение 30 с, отжиг при 65 °C в течение 30 с и удлинение при 95 °C в течение 30 с. 72 °С в течение 1 мин. За этим следовали двенадцать циклов денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг, начинающийся при 65°С в течение 30 с и уменьшающийся на 0,75°С в каждом цикле, и удлинение при 72°С в течение 1 мин. Наконец, двадцать три цикла денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг при 56°С в течение 30 с,
Смеси продуктов f-AFLP подвергали денатурации путем обработки их формамидом при температуре 94 °С в течение 2 мин. Впоследствии эти денатурированные смеси разделяли электрофорезом с использованием генетического анализатора ABI Prism 3730xl, который производится Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Использовали десять комбинаций селективных праймеров AFLP. Затем каждый отдельный гибрид исследовали для определения наличия или отсутствия конкретных фрагментов. Размер обнаруженных фрагментов определяли с использованием программы GeneMapper 4.0 вместе с внутренним стандартом, известным как GS 500 LIZ, который также был предоставлен Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров,20 ].

2.3. Индекс регенерации

Присутствие и плотность A. fruticosa оценивались в приоритетном местообитании 91E0* в районе Нестос на северо-востоке Греции ( рис. 1 ). Пятнадцать (15) участков, каждый площадью 706,86 м 2 , были выбраны случайным образом и равномерно размещены по всей территории обитания 91E0*. В дальнейшем был проведен анализ состава и структуры древесных пород на этих участках. A. fruticosa присутствовала на четырех участках из 15, из которых три располагались на западном берегу реки и один на восточном. У особей A. fruticosa измеряли высоту дерева (м), плотность (особей га -1 ) и индекс регенерации (IR) . IR рассчитывали путем умножения плотности A. fruticosa (на м2 ) по средней высоте A. fruticosa (см) и позволяет оценить степень регенерации [ 20 ].
Экология 04 00041 g001
Рисунок 1. Amorpha fruticosa , распространенная на приоритетном местообитании 91Ε0* в дельте Нестоса, на северо-востоке Греции.

2.4. Сбор данных и статистический анализ данных AFLP

Для преобразования информации о размере аллелей, полученной с помощью GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems, США), в двоичный формат использовался макрос AFLP Excel. Этот макрос присваивал значение «1» присутствующим фрагментам и «0» отсутствующим. Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров, подсчитывали и подвергали дополнительному изучению только согласованные фрагменты, попадающие в диапазон от 150 до 500 пар оснований [ 21 ]. Кроме того, GenAlex v6.0 [ 22 ] использовался для расчета таких параметров, как процент полиморфных полос (P), информационный индекс Шеннона (I) и генетическое разнообразие (He). GenAlex v6.0 также использовался для проведения анализа молекулярной дисперсии (AMOVA), а также для расчета генетических расстояний и анализа главных координат (PCoA).
Подробно, анализ главных координат (PCoA) представляет собой многомерный метод, который позволяет находить и отображать основные закономерности в многомерном наборе данных (например, множественных локусах и множественных образцах). Математика сложна, но, по сути, PCoA — это процесс, с помощью которого основные оси вариаций располагаются в многомерном наборе данных. Для многомерных наборов данных каждая последующая ось объясняет пропорционально меньшую часть общей вариации, так что при наличии отдельных групп первые две или три оси обычно выявляют большую часть разделения между ними. Предусмотрено четыре различных варианта: два основаны на преобразовании матрицы расстояний в ковариационную матрицу, а два работают непосредственно на основе входной матрицы расстояний. Матрица расстояний используется как пул для расчета распределения по осям [22 ].

2.5. Информация о среде обитания 91E0*

Местообитание 91E0* в дельте реки Нестос простирается на небольших высотах (<100 м над уровнем моря) с поверхностями от умеренного до плоского рельефа (уклон 0–10%) (выборка личных данных Коракаки Э. и Карецоса Г.). В его состав входят доминирующие виды деревьев, такие как Fraxinus excelsior L. и Alnus Glutinosa (L.) Gaertn., а также Fraxinus angustifolia Vahl, Salix alba L., Populus alba L., Pinus nigra JF Arnold, Juglans regia L., Cornus sanguinea. L., Ulmus major Mill. и Quercus robur subsp. pedunculiflora (К. Кох) Меницкого. Существует множество вьющихся растений (например,Periploca graeca L. и др.), а травянистый ярус неизменно включает множество видов (например, Aegopodium podagraria L., Hedera helix L., Lysimachia punctata L., Circaea lutetiana L., Arum maculatum L. и др.) (Solomou Выборка персональных данных А. и Карецоса Г.). Дельта Нестоса образована аллювиальными отложениями реки Нестос. Речные отложения состоят из аллювиальных отложений глин, песков и гравия, тогда как пойменные отложения состоят преимущественно из глин и песков [ 23 ].

3. Результаты

3.1. Генетические результаты

Семь комбинаций праймеров AFLP дали 313 локусов для двух популяций. По результатам AFLP, восточная популяция имела полиморфизм 83,39%, а западная — 83,07%. Средняя ожидаемая гетерозиготность (He) составляла 0,127, а западная популяция имела среднюю гетерозиготность немного выше (0,136), чем восточная (0,119). Параметры генетического разнообразия представлены в Таблице 1 вместе с эпигенетическими результатами.
Таблица 1. Среднее значение и стандартная ошибка (SE) для Na (количество аллелей), Ne (количество эффективных аллелей), I (информационный индекс Шеннона) и He (ожидаемая гетерозиготность).
AMOVA (анализ молекулярной дисперсии) определил 97% генетических вариаций внутри популяций и 3% только между популяциями ( рис. 2 ). Анализ основных координат объяснил 16,89% дисперсии ( рис. 3 ).
Экология 04 00041 g002
Рисунок 2. Анализ молекулярной дисперсии среди популяций и внутри них: дисперсия среди популяций составила 3%, а внутри - 97%. Генетическая вариация фрагментов AFLP, использованных для анализа AMOVA.
Экология 04 00041 g003
Рисунок 3. Анализ основных координат объяснил 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы в зависимости от происхождения популяций. На рисунке обозначена небольшая группировка двух популяций, полученная на основе матрицы генетических расстояний генотипов.

3.2. Плотность и индекс регенерации

На четырех участках было зарегистрировано в общей сложности 233 особи A. fruticosa , в результате чего средняя плотность составила 824,07 растений на гектар. Примечательно, что плотность A. fruticosa и индекс регенерации (IR) оказались выше у популяции, проживающей на западном берегу реки, по сравнению с восточным берегом реки. Однако стоит отметить, что средняя высота деревьев была выше на восточном берегу реки, как указано в Таблице 2 . В аллювиальном лесу наиболее широко распространено возобновление чужеродных видов A. fruticosa и A. negundo (личное сообщение Коракаки).
Таблица 2. Средняя высота, средняя плотность и средний индекс регенерации (IR).

4. Дискуссия

Сообщается, что ложное индиго ( Amorpha fruticosa L.) является неместным [ 15 ], и недавние наблюдения зафиксировали его присутствие на значительных территориях вдоль рек Ардас, Эврос и Нестос на северо-востоке Греции, что указывает на его завоз из соседней Болгарии. , возможно, через речной транспорт генетического материала. В прибрежных лесах реки Нестос на северо-востоке Греции A. fruticosa демонстрирует значительную динамику регенерации и, по-видимому, подавляет растительность в важных приоритетных местообитаниях.
В этом исследовании мы оценили генетическое разнообразие двух популяций с западного и восточного берегов реки Нестос, чтобы оценить, имеют ли они различия в генетических параметрах или имеют ли они схожие индексы генетического разнообразия. По оценкам локусов AFLP, гетерозиготность западной популяции была немного выше, но существенно не отличалась от восточной популяции. Более того, как показал анализ AMOVA, большая часть генетических вариаций наблюдалась внутри популяций (97%). Анализ основных координат объяснил лишь 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы по происхождению популяций. Главный вывод генетического анализа заключался в том, что западные и восточные популяции имеют общий генетический фонд, который поступает с водой через реку Нестос.
Что касается аналогичных исследований, авторы не обнаружили никаких упоминаний о генетическом разнообразии с использованием молекулярных маркеров растений A. fruticosa . Однако есть одно исследование [ 24 ], в котором они измерили 47 агрономических и морфологических признаков энергии биомассы. Результаты показали, что на все признаки повлияли образцы, и это ключ, который также может демонстрировать генетическое содержание, которое, вероятно, влияет на изменчивость. Кроме того, были проведены исследования экспрессии генов, связанных с засухой [ 25 ], фенольных компонентов [ 26 ], протеомного анализа симбиотических белков [ 27 ] и исследований рака [ 28 , 29] .]. Вышеупомянутые исследования с одной точки зрения указывают на значение A. fruticosa , хотя мы не можем исключить негативное воздействие, которое он оказывает на экосистемы из-за его быстрого распространения. Этот инвазивный вид может проникнуть в луговые сообщества и быстро превратить среду обитания в густые и однородные заросли. Он вытесняет местные растения и нарушает естественную сукцессию растений и биоразнообразие. Это представляет собой серьезную угрозу, поскольку подавляет местные виды деревьев в приоритетном аллювиальном лесу дельты Нестоса (91E0*). Кроме того, это ставит под угрозу выживание видов Emys orbcularis , Testudo Hermanni и Callimorpha Quadripunctaria *, поскольку они зависят от этих мест обитания.
Согласно нашим выводам, A. fruticosa более активно развивается на западном берегу реки Нестос, что представляет значительный риск для биоразнообразия и подавления местных видов деревьев в аллювиальных лесах региона Нестос. Таким образом, любые природоохранные меры и действия по управлению лесами, направленные на ограничение распространения A. fruticosa , должны быть приоритетными на этом берегу реки. Меры по сохранению необходимы для защиты и поддержания этой естественной среды обитания, которая представляет значительный интерес для сообщества. Действия также должны быть направлены на повышение осведомленности об угрозах, с которыми сталкиваются аллювиальные леса, и на обеспечение их долгосрочной защиты и сохранения. Этот результат ИК дает нам первое указание на то, что A. fruticosaбудет более обширным на западной стороне, и результат небольшой, но более высокой гетерозиготности согласуется с текущим результатом. С 2021 года Институт средиземноморских лесных экосистем (ELGO-DIMITRA) разрабатывает различные экспериментальные методы лечения, чтобы изучить возможные решения по ограничению распространения A. fruticosa .
Наконец, в этом исследовании мы обнаружили аналогичный генетический пул с восточного и западного берегов реки Нестос, который, вероятно, происходит из Болгарии. Будущие исследования должны также включать генетический анализ этих болгарских популяций. Считается необходимым продолжить исследования и изучение A. fruticosa в ближайшие годы, чтобы было более полное знание этого вида и его влияния на экосистему, чтобы затем можно было создать и создать систему управления этим видом. его преимущества можно использовать, не оказывая негативного воздействия на экосистему.

5. Выводы

Первое сообщение о генетическом разнообразии и распространении чужеродного вида Amorpha fruticosa L. было впервые использовано за рекой Нестос в Греции. Мы изучили две популяции, одну с западной стороны и одну с восточной стороны, с маркерами AFLP, и не обнаружили дифференциации между ними. Это указывает на то, что, вероятно, один генетический пул был передан через реку из Болгарии, и будущие исследования должны также охватывать болгарские популяции. Кроме того, проведенная первая оценка состояния регенерации также указывает на расширение вида. Это обязательный шаг для оценки и предложения мер управления с целью сохранения и ограничения распространения вида, который оказывает существенное негативное воздействие на среду обитания 91E0*.

Вклад автора

Концептуализация, EVA и EK; методология, EVA, EK, EM, ADS, GM и ГК; программное обеспечение, EVA, EM и EK; проверка, все; ресурсы, EVA и EK; курирование данных, EVA и EK; письмо — подготовка оригинального проекта, EVA, EK, EM и ADS; написание — просмотр и редактирование, все; надзор, EVA и EK; администрация проекта, ЭК; приобретение финансирования, Е.К. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Это исследование финансировалось проектом LIFE PRIMED, LIFE17 NAT/GR/000511, который софинансируется Греческим зеленым фондом (GRFU).

Заявление о доступности данных

Данные недоступны.

Конфликт интересов

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Рекомендации

  1. Ричардсон, DM; Пышек, П.; Рейманек, М.; Барбур, Миннесота; Панетта, Флорида; Уэст, К.Дж. Натурализация и вторжение чужеродных растений: концепции и определения. Дайверы. Распредел. 2000 , 6 , 93–107. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  2. Коракаки, ​​Э.; Легакис, А.; Кацаневакис, С.; Кулелис, П.; Аврамиду, Э.; Сулиоти, Н.; Петракис, П. Инвазивные чужеродные виды Греции. Обсервация инвазивных чужеродных видов. Проблемы вокруг света 2021 , 3 , 124–189. [ Академика Google ]
  3. Мияваки, С.; Вашитани, И. Инвазивные чужеродные виды растений в прибрежных районах Японии: вклад сельскохозяйственных сорняков, видов восстановления растительности и аквакультурных видов. Глоб. Окружающая среда. Рез.-англ. Эд. 2004 , 8 , 89–101. [ Академика Google ]
  4. Каллауэй, РМ; Ашехуг, Э.Т. Инвазивные растения против их новых и старых соседей: механизм экзотического вторжения. Наука 2000 , 290 , 521–523. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  5. Иванеску, Б.; Лунгу, К.; Власе, Л.; Градинару, AC; Тухилус, К. ВЭЖХ-анализ фенольных соединений, антиоксидантной и противомикробной активности Amorpha fruticosa L. Экстракты. Дж. Плант Дев. 2019 , 26 , 77. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  6. Штрауб, Южная Каролина; Извините, бакалавр; Уикли, А.С. Amorpha confusa , новое название старой Amorpha (Fabaceae: Amorpheae). Дж. Бот. Рез. Инст. Техас, 2009 г. , 151–155. [ Академика Google ]
  7. Штрауб, Южная Каролина; Дойл, Дж. Дж. Молекулярная филогенетика Amorpha (Fabaceae): оценка монофилии, видовых отношений и полиплоидного происхождения. Мол. Филогенетика Эвол. 2014 , 76 , 49–66. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  8. Лю, Дж.; Ван, ET; Chen, WX Разнообразные ризобии, связанные с древесными бобовыми культурами Wisteria sinensis , Cercis Racemosa и Amorpha fruticosa, выращиваемыми в умеренной зоне Китая. Сист. Прил. Микробиол. 2005 , 28 , 465–477. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  9. Китайский, П. Словарь китайской Materia Medica ; Китайская научно-техническая медицинская пресса: Пекин, Китай, 1997. [ Google Scholar ]
  10. Митчер, Луизиана; Парк, Ю.Х.; Альшамма, А.; Хадсон, ПБ; Хаас, Т. Аморфрутин a и b, бибензиловые противомикробные средства из Amorpha fruticosa . Фитохимия 1981 , 20 , 781–785. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  11. Крпан, АП; Томашич, Ж.; Башич Палкович, П. Биопотенциал индигобуша ( Amorpha fruticosa L.) – второй год исследования. Список Шумарского. 2011 , 135 , 103–112. [ Академика Google ]
  12. Кожухарова Е.; Матковский, А.; Возняк, Д.; Симеонова Р.; Найчов З.; Малайнер, К.; Мокан, А.; Набави, С.М.; Атанасов А.Г. Amorpha fruticosa – вредоносное инвазионное чужеродное растение в Европе или лекарственное растение от болезней обмена веществ? Передний. Фармакол. 2017 , 8 , 333. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  13. Сигетвари, К. Первые шаги по восстановлению пойменного луга после десятилетия доминирования инвазивного кустарника-трансформера Amorpha fruticosa L. Tiscia 2002 , 33 , 67–77. [ Академика Google ]
  14. Педашенко, Л.П.; Апостолова, И.И.; Васильев К.В. Невселенность Amorpha fruticosa в различных местообитаниях нижнего Дуная. Фитол. Балк. 2012 , 18 , 285–291. [ Академика Google ]
  15. Ариануцу, М.; Базос, И.; Делипетру, П.; Коккорис, Ю. Инопланетная флора Греции: таксономия, особенности жизни и предпочтения среды обитания. Биол. Вторжения 2010 , 12 , 3525–3549. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  16. Самарас, АГ; Коутитас, К.Г. Моделирование воздействия на прибрежную морфологию управления водными ресурсами в трансграничных речных бассейнах: пример реки Нестос. Менеджер. Окружающая среда. Квал. Межд. Дж. 2008 , 19 , 455–466. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  17. Декамп, Х.; Декамп, О. Средиземноморские прибрежные леса ; Сохранение водно-болотных угодий Средиземноморья; Тур дю Валат: Арль, Франция, 2001 г. [ Google Scholar ]
  18. Маллинис, Г.; Эмманолудис, Д.; Яннакопулос, В.; Марис, Ф.; Куциас, Н. Картирование и интерпретация исторических изменений растительного покрова/землепользования на участке «Натура 2000» с использованием данных наблюдений за Землей: пример дельты Нестоса, Греция. Прил. геогр. 2011 , 31 , 312–320. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  19. Дафис, С.; Папастергиаду, Э.; Георгиу, К.; Бабалонас, Д.; Георгиадис, Т.; Папагеоргиу, М.; Лазариду, Т.; Циаусси, В. Греческий проект «среды обитания» Natura 2000: Обзор. Пожизненный контракт B4-32000/94/756 ; Комиссия Европейских Сообществ, Музей естественной истории Гуландриса, Центр греческих биотопов и водно-болотных угодий; Springer: Берлин/Гейдельберг, Германия, 1996. [ Google Scholar ]
  20. Бьянки, Л.; Пачи, М. Эволюционная динамика и тосканское обучение: Sintesi di quarant'anni di richerche. Для.-Ж. Сильвик. Для. Экол. 2008 , 5 , 122. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
  21. Векеманс, X.; Боуэнс, Т.; Лемэр, М.; Ролдан-Руис, И. Данные маркеров амплифицированного полиморфизма длин фрагментов (AFLP) указывают на гомоплазию по размеру и взаимосвязь между степенью гомоплазии и размером фрагмента. Мол. Экол. 2002 , 11 , 139–151. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  22. Пикалл, РОД; Смаус, ЧП Genalex 6: Генетический анализ в Excel. Программное обеспечение популяционной генетики для обучения и исследований. Мол. Экол. Примечания 2006 , 6 , 288–295. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  23. Тафтсоглу, М.; Валканиотис, С.; Папатанасиу, Г.; Климис, Н.; Докас, И. Подробная карта подверженности разжижению дельты реки Нестос, Фракия, Греция, основанная на поверхностной геологии и геоморфологии. Geosciences 2022 , 12 , 361. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  24. ДеХаан, Л.; Эльке, Н.; Шиффер, К.; Вайз, Д.; ДеХаан, Р. Оценка разнообразия североамериканских образцов ложного индиго ( Amorpha fruticosa L.) для корма и биомассы. Жене. Ресурс. Кроп Эвол. 2006 , 53 , 1463–1476. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  25. Ли, М.; Лю, З.; Лю, К.; Чжу, Ф.; Ван, К.; Ван, З.; Ли, Х.; Лан, X.; Гуан, К. Засухоустойчивость табака, сверхэкспрессирующего ген afnac1 Amorpha fruticosa Linn. Передний. Наука о растениях. 2022 , 13 , 980171. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  26. Дат, Северная Каролина; Ли, Дж.-Х.; Лук-порей.; Хонг, Ю.-С.; Ким, Ю.Х.; Ли, Дж. Дж. Фенольные компоненты Amorpha fruticosa , которые ингибируют активацию nf-κb и связанную с ней экспрессию генов. Дж. Нэт. Прод. 2008 , 71 , 1696–1700. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  27. Песня, Ф.; Ци, Д.; Лю, X.; Конг, X.; Гао, Ю.; Чжоу, З.; Ву, К. Протеомный анализ симбиотических белков Glomus mosseae и Amorpha fruticosa . наук. Rep. 2015 , 5 , 18031. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  28. Тодорова Т.; Бояджиев, К.; Шкондров А.; Пырванова П.; Димитрова, М.; Ионкова И.; Крастева И.; Кожухарова Е.; Чанкова, С. Скрининг экстрактов Amorpha fruticosa и Ailanthus altissima на генотоксичность/антигенотоксичность, мутагенность/антимутагенность и канцерогенность/антиканцерогенность. БиоРиск 2022 , 17 , 201–212. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  29. Цветкович, Д.М.; Йованкич, СП; Милутинович, М.Г.; Никодиевич, Д.Д.; Грбович, Ф.Дж.; Чирич, АР; Топузович, доктор медицинских наук; Маркович, С.Д. Противоинвазивная активность Robinia pseudoacacia L. и Amorpha fruticosa L. На клеточной линии рака молочной железы mda-mb-231. Биология 2019 , 74 , 915–928. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
Чужеродные и инвазивные растения угрожают целостности природных экосистем, поскольку большинство из них являются инвазивными, конкурируют с местными растениями и во многих случаях занимают их место в экосистеме. Инвазивные виды характеризуются быстрым распространением за счет производства большого количества потомства, которое может рассеиваться на большие расстояния [ 1 ]. Более того, они имеют высокую выживаемость благодаря своей пластичности, способной реагировать на различные условия окружающей среды. Кроме того, некоторые природные явления могут способствовать их распространению, например, наводнения, ветер, поверхностная эрозия и т. д.
На распространение инвазивных видов также существенно повлияла деятельность человека [ 2 ]. С древних времен чужеродные растения случайно или намеренно переносились в новые места обитания и культивировались как садовые или декоративные растения [ 3 ]. Их распространению способствует также деятельность человека, роль которой двоякая: транспортировка размножающегося материала и изменение среды обитания. Главное преимущество заключается в том, что у них нет физических врагов, которые бы контролировали их население, чтобы они в полной мере использовали свой конкурентный потенциал. Некоторые инвазивные растения также развивают новые механизмы взаимодействия с природными экосистемами [ 4 ]. Одним из таких механизмов является продукция аллелопатических веществ и их выброс в экосистему [ 5].
Amorpha L. ( Fabaceae Juss.: Amorpheae Britains .) — род из 16 видов, произрастающих в Северной Америке [ 6 ]. Эти растения могут представлять собой кустарники, полукустарники или травянистые многолетние растения и встречаются в различных средах обитания, включая прибрежные коридоры, саванны и луга. Многие виды Amorpha имеют очень ограниченное распространение, а некоторые считаются находящимися под угрозой исчезновения [ 7 ].
Amorpha fruticosa L. (куст индиго) — многолетний листопадный кустарник, принадлежащий к семейству Fabaceae и произрастающий в юго-западной части Северной Америки [ 8 ]. Куст индиго был завезен в Европу как декоративное растение [ 5 ]. Его используют как лекарство для лечения ожогов и экземы [ 9 ]. В последние годы ему уделяется особое внимание из-за его биологической активности. Исследования показали, что это растение богато полифенолами и содержит биологически активные ингредиенты. Он также обладает противораковой, противовоспалительной и противомикробной активностью [ 10] .]. Куст индиго – растение, имеющее большую декоративную ценность и используемое при обустройстве городских ландшафтов и при охране склонов. Он может выжить в сухих почвах, но предпочитает берега рек и опушки затопленных лесов, где легко распространяется водой, поскольку его семенные коробочки плавучие [11 ] . Его высокая толерантность к различным климатическим условиям, а также отличная способность к размножению дают ему возможность с легкостью расти за пределами своего естественного распространения [ 12 ]. Сегодня он признан одним из наиболее инвазивных видов в Европе, оказывающим серьезное воздействие на местные экосистемы [ 11 ]. Это светолюбивое растение, конкурирующее за свет, образующее густые заросли, затмевающие местную флору, а это приводит к снижению биоразнообразия [ 11, 12 , 13 ]. Из-за ущерба, который он наносит природным экосистемам и водному хозяйству, следует немедленно принять меры по сокращению/контролю его популяции.
В Греции трансграничные реки, такие как Нестос, Аксиос и др., являются транспортными коридорами для чужеродных видов растений, которые расширяют свой ареал за счет воды [ 14 ]. Однако, помимо конкретного вида транспорта, в последние годы в Грецию были интродуцированы многие зарубежные виды растений, как намеренно (например, декоративные и лекарственные растения), так и непреднамеренно, используя различные способы интродукции [2 ] . Хотя число чужеродных видов велико, не все из них являются инвазивными. Из 343 чужеродных видов только 50 проявляют инвазионное поведение, и большинство из них имеют американское происхождение [ 15 ].
Нестос — трансграничная река Болгарии и Северной Греции. Берет начало от горы Рила на юге Болгарии и проходит между горными хребтами Аймос и Родопы. Его длина составляет 234 км, из них 130 км находится на территории Греции [ 16 ]. Прежде чем впасть в море, он простирается через равнину Хрисуполис и расширяется как дельтовая система с пресноводными озерами, образующими дельту Нестоса. В этой зоне существует приоритетная среда обитания 91E0 (Приложение I Директивы 92/43/EEC), в которой представлены два подтипа: подтип ольховых насаждений ( Alnus Glutinosa ) и подтип тополя белого ( Populus alba ) и вяза ( Ulmusminor ).) стоит. Первый подтип состоит из чистых насаждений ольхи, произрастающих на легких и умеренно легких почвах с очень хорошими физическими свойствами, которые можно охарактеризовать как Calcaric fluvisols. При этом уровень грунтовых вод относительно высокий (90–95 см). Этот подтип встречается между дамбами, местами вблизи берегов рек или в местах, удаленных от них на несколько десятков метров. Второй подтип составляет значительную часть тугайного леса и располагается за пределами дамб. Он состоит из насаждений белого тополя и вяза, которые растут на глубоких и умеренно легких почвах с хорошими физическими свойствами, принадлежащих к типу почв Eutric Fluvisol, без проблем с щелочностью и засоленностью. Уровень грунтовых вод низкий, но сильно колеблется [ 17 ].
Территория вдоль реки существенно изменилась со времен Второй мировой войны [ 18 ]. В 1945 году на этой территории преобладали леса и водно-болотные угодья. В 1960-е годы площадь сельскохозяйственных угодий увеличилась, что привело к уменьшению лесных площадей. Также произошло значительное сокращение площади водно-болотных угодий из-за их преобразования в пастбища. Однако, несмотря на сильное упадок природной экосистемы, в этом районе по-прежнему сохраняется самый обширный речной лес в Греции. Кроме того, равнина реки Нестос имеет важное экологическое значение из-за множества важных мест обитания. Он был классифицирован как водно-болотное угодье международного значения и включен в Рамсарскую конвенцию. Он также защищен Бернской конвенцией, директивами Европейской комиссии и законодательством Греции. Кроме того, он принадлежит к сети Natura 2000.19 ].
В Греции Amorpha fruticosa L. считается инвазивным видом, поскольку это растение способно распространяться на обширной территории. В настоящей работе изучено генетическое разнообразие популяций Amorpha fruticosa L., произрастающих вдоль реки Нестос. Наши цели заключались в том, чтобы (1) определить уровень генетической дифференциации, если она существует, между двумя берегами реки: западным и восточным; (2) оценить степень инбридинга в каждой популяции, а также эффективный размер популяции; и (3) обсудить последствия расширения конкретных видов в естественной экосистеме и, более конкретно, в популяциях местных видов в этом районе.

2. Материалы и методы

2.1. Растительный материал

Сбор образцов листьев проведен на 20 особях Amorpha fruticosa из 2 популяций района реки Нестос (ориентировочные координаты западной популяции A: X: 565671, Y: 4527927 и восточной популяции: X: 566918, Y: 4525481). Экстракцию ДНК из свежей хвои проводили с помощью набора Macherey Nagel Plant (Düren, Северный Рейн-Вестфалия, Германия) в соответствии с протоколом производителя.

2.2. Процедура ПФЛП

Всего 200 нг геномной ДНК фрагментировали расщеплением 4 ед. ферментов EcoRI и MseI при температуре 37°С в течение 3 часов. Расщепленные фрагменты ДНК затем объединяли с адаптерами EcoRI и MseI и полученную смесь лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 от New England Biolabs (Ипсвич, Массачусетс, США). Этот этап лигирования проводили при температуре 26°C в течение 3 часов. Полученную в результате этого процесса ДНК использовали в качестве первичной матрицы для анализа AFLP.
Для этапа преамплификации использовали пару праймеров на основе последовательностей адаптеров EcoRI и MseI с дополнительным селективным нуклеотидом на 3'-конце (EcoRI+A и MseI+C). ПЦР с предварительной амплификацией проводили в общем объеме 20 мкл, который содержал 1X буфер Kapa Taq, 0,2 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl 2., 30 нг каждого праймера (EcoRI+A и MseI+C), 1 единица ДНК-полимеразы Taq от Kapa Biosystems (расположена в Уилмингтоне, Массачусетс, США) и 5 ​​мкл разведенных фрагментов ДНК, полученных в результате реакции расщепления и лигирования. . Условия циклирования ПЦР были следующими: начальная денатурация при 95 °С в течение 30 с, затем 32 цикла денатурации при 95 °С в течение 30 с, отжиг при 56 °С в течение 30 с, удлинение при 72 °С в течение 1 мин. и заключительный этап удлинения при 72 ° C в течение 10 минут. Для подтверждения амплификации образец реакции объемом 5 мкл подвергали электрофорезу в агарозном геле, а оставшиеся 15 мкл разбавляли в 5 раз ТЕ-буфером.
Селективную амплификацию проводили в реакционных объемах объемом 10 мкл, состоящих из 3 мкл разбавленной преселективной матрицы, и с использованием тех же условий реакции, что и на стадии преселективной амплификации, за исключением использования 30 нг праймера MseI и 5 нг праймера EcoRI. за реакцию. Программа циклической селективной амплификации осуществлялась с использованием термоциклера BioRad (Hercules, Калифорния, США) по следующей схеме: начальный цикл денатурации при 95 °C в течение 30 с, отжиг при 65 °C в течение 30 с и удлинение при 95 °C в течение 30 с. 72 °С в течение 1 мин. За этим следовали двенадцать циклов денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг, начинающийся при 65°С в течение 30 с и уменьшающийся на 0,75°С в каждом цикле, и удлинение при 72°С в течение 1 мин. Наконец, двадцать три цикла денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг при 56°С в течение 30 с,
Смеси продуктов f-AFLP подвергали денатурации путем обработки их формамидом при температуре 94 °С в течение 2 мин. Впоследствии эти денатурированные смеси разделяли электрофорезом с использованием генетического анализатора ABI Prism 3730xl, который производится Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Использовали десять комбинаций селективных праймеров AFLP. Затем каждый отдельный гибрид исследовали для определения наличия или отсутствия конкретных фрагментов. Размер обнаруженных фрагментов определяли с использованием программы GeneMapper 4.0 вместе с внутренним стандартом, известным как GS 500 LIZ, который также был предоставлен Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров,20 ].

2.3. Индекс регенерации

Присутствие и плотность A. fruticosa оценивались в приоритетном местообитании 91E0* в районе Нестос на северо-востоке Греции ( рис. 1 ). Пятнадцать (15) участков, каждый площадью 706,86 м 2 , были выбраны случайным образом и равномерно размещены по всей территории обитания 91E0*. В дальнейшем был проведен анализ состава и структуры древесных пород на этих участках. A. fruticosa присутствовала на четырех участках из 15, из которых три располагались на западном берегу реки и один на восточном. У особей A. fruticosa измеряли высоту дерева (м), плотность (особей га -1 ) и индекс регенерации (IR) . IR рассчитывали путем умножения плотности A. fruticosa (на м2 ) по средней высоте A. fruticosa (см) и позволяет оценить степень регенерации [ 20 ].
Экология 04 00041 g001
Рисунок 1. Amorpha fruticosa , распространенная на приоритетном местообитании 91Ε0* в дельте Нестоса, на северо-востоке Греции.

2.4. Сбор данных и статистический анализ данных AFLP

Для преобразования информации о размере аллелей, полученной с помощью GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems, США), в двоичный формат использовался макрос AFLP Excel. Этот макрос присваивал значение «1» присутствующим фрагментам и «0» отсутствующим. Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров, подсчитывали и подвергали дополнительному изучению только согласованные фрагменты, попадающие в диапазон от 150 до 500 пар оснований [ 21 ]. Кроме того, GenAlex v6.0 [ 22 ] использовался для расчета таких параметров, как процент полиморфных полос (P), информационный индекс Шеннона (I) и генетическое разнообразие (He). GenAlex v6.0 также использовался для проведения анализа молекулярной дисперсии (AMOVA), а также для расчета генетических расстояний и анализа главных координат (PCoA).
Подробно, анализ главных координат (PCoA) представляет собой многомерный метод, который позволяет находить и отображать основные закономерности в многомерном наборе данных (например, множественных локусах и множественных образцах). Математика сложна, но, по сути, PCoA — это процесс, с помощью которого основные оси вариаций располагаются в многомерном наборе данных. Для многомерных наборов данных каждая последующая ось объясняет пропорционально меньшую часть общей вариации, так что при наличии отдельных групп первые две или три оси обычно выявляют большую часть разделения между ними. Предусмотрено четыре различных варианта: два основаны на преобразовании матрицы расстояний в ковариационную матрицу, а два работают непосредственно на основе входной матрицы расстояний. Матрица расстояний используется как пул для расчета распределения по осям [22 ].

2.5. Информация о среде обитания 91E0*

Местообитание 91E0* в дельте реки Нестос простирается на небольших высотах (<100 м над уровнем моря) с поверхностями от умеренного до плоского рельефа (уклон 0–10%) (выборка личных данных Коракаки Э. и Карецоса Г.). В его состав входят доминирующие виды деревьев, такие как Fraxinus excelsior L. и Alnus Glutinosa (L.) Gaertn., а также Fraxinus angustifolia Vahl, Salix alba L., Populus alba L., Pinus nigra JF Arnold, Juglans regia L., Cornus sanguinea. L., Ulmus major Mill. и Quercus robur subsp. pedunculiflora (К. Кох) Меницкого. Существует множество вьющихся растений (например,Periploca graeca L. и др.), а травянистый ярус неизменно включает множество видов (например, Aegopodium podagraria L., Hedera helix L., Lysimachia punctata L., Circaea lutetiana L., Arum maculatum L. и др.) (Solomou Выборка персональных данных А. и Карецоса Г.). Дельта Нестоса образована аллювиальными отложениями реки Нестос. Речные отложения состоят из аллювиальных отложений глин, песков и гравия, тогда как пойменные отложения состоят преимущественно из глин и песков [ 23 ].

3. Результаты

3.1. Генетические результаты

Семь комбинаций праймеров AFLP дали 313 локусов для двух популяций. По результатам AFLP, восточная популяция имела полиморфизм 83,39%, а западная — 83,07%. Средняя ожидаемая гетерозиготность (He) составляла 0,127, а западная популяция имела среднюю гетерозиготность немного выше (0,136), чем восточная (0,119). Параметры генетического разнообразия представлены в Таблице 1 вместе с эпигенетическими результатами.
Таблица 1. Среднее значение и стандартная ошибка (SE) для Na (количество аллелей), Ne (количество эффективных аллелей), I (информационный индекс Шеннона) и He (ожидаемая гетерозиготность).
AMOVA (анализ молекулярной дисперсии) определил 97% генетических вариаций внутри популяций и 3% только между популяциями ( рис. 2 ). Анализ основных координат объяснил 16,89% дисперсии ( рис. 3 ).
Экология 04 00041 g002
Рисунок 2. Анализ молекулярной дисперсии среди популяций и внутри них: дисперсия среди популяций составила 3%, а внутри - 97%. Генетическая вариация фрагментов AFLP, использованных для анализа AMOVA.
Экология 04 00041 g003
Рисунок 3. Анализ основных координат объяснил 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы в зависимости от происхождения популяций. На рисунке обозначена небольшая группировка двух популяций, полученная на основе матрицы генетических расстояний генотипов.

3.2. Плотность и индекс регенерации

На четырех участках было зарегистрировано в общей сложности 233 особи A. fruticosa , в результате чего средняя плотность составила 824,07 растений на гектар. Примечательно, что плотность A. fruticosa и индекс регенерации (IR) оказались выше у популяции, проживающей на западном берегу реки, по сравнению с восточным берегом реки. Однако стоит отметить, что средняя высота деревьев была выше на восточном берегу реки, как указано в Таблице 2 . В аллювиальном лесу наиболее широко распространено возобновление чужеродных видов A. fruticosa и A. negundo (личное сообщение Коракаки).
Таблица 2. Средняя высота, средняя плотность и средний индекс регенерации (IR).

4. Дискуссия

Сообщается, что ложное индиго ( Amorpha fruticosa L.) является неместным [ 15 ], и недавние наблюдения зафиксировали его присутствие на значительных территориях вдоль рек Ардас, Эврос и Нестос на северо-востоке Греции, что указывает на его завоз из соседней Болгарии. , возможно, через речной транспорт генетического материала. В прибрежных лесах реки Нестос на северо-востоке Греции A. fruticosa демонстрирует значительную динамику регенерации и, по-видимому, подавляет растительность в важных приоритетных местообитаниях.
В этом исследовании мы оценили генетическое разнообразие двух популяций с западного и восточного берегов реки Нестос, чтобы оценить, имеют ли они различия в генетических параметрах или имеют ли они схожие индексы генетического разнообразия. По оценкам локусов AFLP, гетерозиготность западной популяции была немного выше, но существенно не отличалась от восточной популяции. Более того, как показал анализ AMOVA, большая часть генетических вариаций наблюдалась внутри популяций (97%). Анализ основных координат объяснил лишь 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы по происхождению популяций. Главный вывод генетического анализа заключался в том, что западные и восточные популяции имеют общий генетический фонд, который поступает с водой через реку Нестос.
Что касается аналогичных исследований, авторы не обнаружили никаких упоминаний о генетическом разнообразии с использованием молекулярных маркеров растений A. fruticosa . Однако есть одно исследование [ 24 ], в котором они измерили 47 агрономических и морфологических признаков энергии биомассы. Результаты показали, что на все признаки повлияли образцы, и это ключ, который также может демонстрировать генетическое содержание, которое, вероятно, влияет на изменчивость. Кроме того, были проведены исследования экспрессии генов, связанных с засухой [ 25 ], фенольных компонентов [ 26 ], протеомного анализа симбиотических белков [ 27 ] и исследований рака [ 28 , 29] .]. Вышеупомянутые исследования с одной точки зрения указывают на значение A. fruticosa , хотя мы не можем исключить негативное воздействие, которое он оказывает на экосистемы из-за его быстрого распространения. Этот инвазивный вид может проникнуть в луговые сообщества и быстро превратить среду обитания в густые и однородные заросли. Он вытесняет местные растения и нарушает естественную сукцессию растений и биоразнообразие. Это представляет собой серьезную угрозу, поскольку подавляет местные виды деревьев в приоритетном аллювиальном лесу дельты Нестоса (91E0*). Кроме того, это ставит под угрозу выживание видов Emys orbcularis , Testudo Hermanni и Callimorpha Quadripunctaria *, поскольку они зависят от этих мест обитания.
Согласно нашим выводам, A. fruticosa более активно развивается на западном берегу реки Нестос, что представляет значительный риск для биоразнообразия и подавления местных видов деревьев в аллювиальных лесах региона Нестос. Таким образом, любые природоохранные меры и действия по управлению лесами, направленные на ограничение распространения A. fruticosa , должны быть приоритетными на этом берегу реки. Меры по сохранению необходимы для защиты и поддержания этой естественной среды обитания, которая представляет значительный интерес для сообщества. Действия также должны быть направлены на повышение осведомленности об угрозах, с которыми сталкиваются аллювиальные леса, и на обеспечение их долгосрочной защиты и сохранения. Этот результат ИК дает нам первое указание на то, что A. fruticosaбудет более обширным на западной стороне, и результат небольшой, но более высокой гетерозиготности согласуется с текущим результатом. С 2021 года Институт средиземноморских лесных экосистем (ELGO-DIMITRA) разрабатывает различные экспериментальные методы лечения, чтобы изучить возможные решения по ограничению распространения A. fruticosa .
Наконец, в этом исследовании мы обнаружили аналогичный генетический пул с восточного и западного берегов реки Нестос, который, вероятно, происходит из Болгарии. Будущие исследования должны также включать генетический анализ этих болгарских популяций. Считается необходимым продолжить исследования и изучение A. fruticosa в ближайшие годы, чтобы было более полное знание этого вида и его влияния на экосистему, чтобы затем можно было создать и создать систему управления этим видом. его преимущества можно использовать, не оказывая негативного воздействия на экосистему.

5. Выводы

Первое сообщение о генетическом разнообразии и распространении чужеродного вида Amorpha fruticosa L. было впервые использовано за рекой Нестос в Греции. Мы изучили две популяции, одну с западной стороны и одну с восточной стороны, с маркерами AFLP, и не обнаружили дифференциации между ними. Это указывает на то, что, вероятно, один генетический пул был передан через реку из Болгарии, и будущие исследования должны также охватывать болгарские популяции. Кроме того, проведенная первая оценка состояния регенерации также указывает на расширение вида. Это обязательный шаг для оценки и предложения мер управления с целью сохранения и ограничения распространения вида, который оказывает существенное негативное воздействие на среду обитания 91E0*.

Вклад автора

Концептуализация, EVA и EK; методология, EVA, EK, EM, ADS, GM и ГК; программное обеспечение, EVA, EM и EK; проверка, все; ресурсы, EVA и EK; курирование данных, EVA и EK; письмо — подготовка оригинального проекта, EVA, EK, EM и ADS; написание — просмотр и редактирование, все; надзор, EVA и EK; администрация проекта, ЭК; приобретение финансирования, Е.К. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Это исследование финансировалось проектом LIFE PRIMED, LIFE17 NAT/GR/000511, который софинансируется Греческим зеленым фондом (GRFU).

Заявление о доступности данных

Данные недоступны.

Конфликт интересов

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Рекомендации

  1. Ричардсон, DM; Пышек, П.; Рейманек, М.; Барбур, Миннесота; Панетта, Флорида; Уэст, К.Дж. Натурализация и вторжение чужеродных растений: концепции и определения. Дайверы. Распредел. 2000 , 6 , 93–107. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  2. Коракаки, ​​Э.; Легакис, А.; Кацаневакис, С.; Кулелис, П.; Аврамиду, Э.; Сулиоти, Н.; Петракис, П. Инвазивные чужеродные виды Греции. Обсервация инвазивных чужеродных видов. Проблемы вокруг света 2021 , 3 , 124–189. [ Академика Google ]
  3. Мияваки, С.; Вашитани, И. Инвазивные чужеродные виды растений в прибрежных районах Японии: вклад сельскохозяйственных сорняков, видов восстановления растительности и аквакультурных видов. Глоб. Окружающая среда. Рез.-англ. Эд. 2004 , 8 , 89–101. [ Академика Google ]
  4. Каллауэй, РМ; Ашехуг, Э.Т. Инвазивные растения против их новых и старых соседей: механизм экзотического вторжения. Наука 2000 , 290 , 521–523. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  5. Иванеску, Б.; Лунгу, К.; Власе, Л.; Градинару, AC; Тухилус, К. ВЭЖХ-анализ фенольных соединений, антиоксидантной и противомикробной активности Amorpha fruticosa L. Экстракты. Дж. Плант Дев. 2019 , 26 , 77. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  6. Штрауб, Южная Каролина; Извините, бакалавр; Уикли, А.С. Amorpha confusa , новое название старой Amorpha (Fabaceae: Amorpheae). Дж. Бот. Рез. Инст. Техас, 2009 г. , 151–155. [ Академика Google ]
  7. Штрауб, Южная Каролина; Дойл, Дж. Дж. Молекулярная филогенетика Amorpha (Fabaceae): оценка монофилии, видовых отношений и полиплоидного происхождения. Мол. Филогенетика Эвол. 2014 , 76 , 49–66. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  8. Лю, Дж.; Ван, ET; Chen, WX Разнообразные ризобии, связанные с древесными бобовыми культурами Wisteria sinensis , Cercis Racemosa и Amorpha fruticosa, выращиваемыми в умеренной зоне Китая. Сист. Прил. Микробиол. 2005 , 28 , 465–477. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  9. Китайский, П. Словарь китайской Materia Medica ; Китайская научно-техническая медицинская пресса: Пекин, Китай, 1997. [ Google Scholar ]
  10. Митчер, Луизиана; Парк, Ю.Х.; Альшамма, А.; Хадсон, ПБ; Хаас, Т. Аморфрутин a и b, бибензиловые противомикробные средства из Amorpha fruticosa . Фитохимия 1981 , 20 , 781–785. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  11. Крпан, АП; Томашич, Ж.; Башич Палкович, П. Биопотенциал индигобуша ( Amorpha fruticosa L.) – второй год исследования. Список Шумарского. 2011 , 135 , 103–112. [ Академика Google ]
  12. Кожухарова Е.; Матковский, А.; Возняк, Д.; Симеонова Р.; Найчов З.; Малайнер, К.; Мокан, А.; Набави, С.М.; Атанасов А.Г. Amorpha fruticosa – вредоносное инвазионное чужеродное растение в Европе или лекарственное растение от болезней обмена веществ? Передний. Фармакол. 2017 , 8 , 333. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  13. Сигетвари, К. Первые шаги по восстановлению пойменного луга после десятилетия доминирования инвазивного кустарника-трансформера Amorpha fruticosa L. Tiscia 2002 , 33 , 67–77. [ Академика Google ]
  14. Педашенко, Л.П.; Апостолова, И.И.; Васильев К.В. Невселенность Amorpha fruticosa в различных местообитаниях нижнего Дуная. Фитол. Балк. 2012 , 18 , 285–291. [ Академика Google ]
  15. Ариануцу, М.; Базос, И.; Делипетру, П.; Коккорис, Ю. Инопланетная флора Греции: таксономия, особенности жизни и предпочтения среды обитания. Биол. Вторжения 2010 , 12 , 3525–3549. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  16. Самарас, АГ; Коутитас, К.Г. Моделирование воздействия на прибрежную морфологию управления водными ресурсами в трансграничных речных бассейнах: пример реки Нестос. Менеджер. Окружающая среда. Квал. Межд. Дж. 2008 , 19 , 455–466. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  17. Декамп, Х.; Декамп, О. Средиземноморские прибрежные леса ; Сохранение водно-болотных угодий Средиземноморья; Тур дю Валат: Арль, Франция, 2001 г. [ Google Scholar ]
  18. Маллинис, Г.; Эмманолудис, Д.; Яннакопулос, В.; Марис, Ф.; Куциас, Н. Картирование и интерпретация исторических изменений растительного покрова/землепользования на участке «Натура 2000» с использованием данных наблюдений за Землей: пример дельты Нестоса, Греция. Прил. геогр. 2011 , 31 , 312–320. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  19. Дафис, С.; Папастергиаду, Э.; Георгиу, К.; Бабалонас, Д.; Георгиадис, Т.; Папагеоргиу, М.; Лазариду, Т.; Циаусси, В. Греческий проект «среды обитания» Natura 2000: Обзор. Пожизненный контракт B4-32000/94/756 ; Комиссия Европейских Сообществ, Музей естественной истории Гуландриса, Центр греческих биотопов и водно-болотных угодий; Springer: Берлин/Гейдельберг, Германия, 1996. [ Google Scholar ]
  20. Бьянки, Л.; Пачи, М. Эволюционная динамика и тосканское обучение: Sintesi di quarant'anni di richerche. Для.-Ж. Сильвик. Для. Экол. 2008 , 5 , 122. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
  21. Векеманс, X.; Боуэнс, Т.; Лемэр, М.; Ролдан-Руис, И. Данные маркеров амплифицированного полиморфизма длин фрагментов (AFLP) указывают на гомоплазию по размеру и взаимосвязь между степенью гомоплазии и размером фрагмента. Мол. Экол. 2002 , 11 , 139–151. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  22. Пикалл, РОД; Смаус, ЧП Genalex 6: Генетический анализ в Excel. Программное обеспечение популяционной генетики для обучения и исследований. Мол. Экол. Примечания 2006 , 6 , 288–295. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  23. Тафтсоглу, М.; Валканиотис, С.; Папатанасиу, Г.; Климис, Н.; Докас, И. Подробная карта подверженности разжижению дельты реки Нестос, Фракия, Греция, основанная на поверхностной геологии и геоморфологии. Geosciences 2022 , 12 , 361. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  24. ДеХаан, Л.; Эльке, Н.; Шиффер, К.; Вайз, Д.; ДеХаан, Р. Оценка разнообразия североамериканских образцов ложного индиго ( Amorpha fruticosa L.) для корма и биомассы. Жене. Ресурс. Кроп Эвол. 2006 , 53 , 1463–1476. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  25. Ли, М.; Лю, З.; Лю, К.; Чжу, Ф.; Ван, К.; Ван, З.; Ли, Х.; Лан, X.; Гуан, К. Засухоустойчивость табака, сверхэкспрессирующего ген afnac1 Amorpha fruticosa Linn. Передний. Наука о растениях. 2022 , 13 , 980171. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  26. Дат, Северная Каролина; Ли, Дж.-Х.; Лук-порей.; Хонг, Ю.-С.; Ким, Ю.Х.; Ли, Дж. Дж. Фенольные компоненты Amorpha fruticosa , которые ингибируют активацию nf-κb и связанную с ней экспрессию генов. Дж. Нэт. Прод. 2008 , 71 , 1696–1700. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  27. Песня, Ф.; Ци, Д.; Лю, X.; Конг, X.; Гао, Ю.; Чжоу, З.; Ву, К. Протеомный анализ симбиотических белков Glomus mosseae и Amorpha fruticosa . наук. Rep. 2015 , 5 , 18031. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  28. Тодорова Т.; Бояджиев, К.; Шкондров А.; Пырванова П.; Димитрова, М.; Ионкова И.; Крастева И.; Кожухарова Е.; Чанкова, С. Скрининг экстрактов Amorpha fruticosa и Ailanthus altissima на генотоксичность/антигенотоксичность, мутагенность/антимутагенность и канцерогенность/антиканцерогенность. БиоРиск 2022 , 17 , 201–212. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  29. Цветкович, Д.М.; Йованкич, СП; Милутинович, М.Г.; Никодиевич, Д.Д.; Грбович, Ф.Дж.; Чирич, АР; Топузович, доктор медицинских наук; Маркович, С.Д. Противоинвазивная активность Robinia pseudoacacia L. и Amorpha fruticosa L. На клеточной линии рака молочной железы mda-mb-231. Биология 2019 , 74 , 915–928. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
Чужеродные и инвазивные растения угрожают целостности природных экосистем, поскольку большинство из них являются инвазивными, конкурируют с местными растениями и во многих случаях занимают их место в экосистеме. Инвазивные виды характеризуются быстрым распространением за счет производства большого количества потомства, которое может рассеиваться на большие расстояния [ 1 ]. Более того, они имеют высокую выживаемость благодаря своей пластичности, способной реагировать на различные условия окружающей среды. Кроме того, некоторые природные явления могут способствовать их распространению, например, наводнения, ветер, поверхностная эрозия и т. д.
На распространение инвазивных видов также существенно повлияла деятельность человека [ 2 ]. С древних времен чужеродные растения случайно или намеренно переносились в новые места обитания и культивировались как садовые или декоративные растения [ 3 ]. Их распространению способствует также деятельность человека, роль которой двоякая: транспортировка размножающегося материала и изменение среды обитания. Главное преимущество заключается в том, что у них нет физических врагов, которые бы контролировали их население, чтобы они в полной мере использовали свой конкурентный потенциал. Некоторые инвазивные растения также развивают новые механизмы взаимодействия с природными экосистемами [ 4 ]. Одним из таких механизмов является продукция аллелопатических веществ и их выброс в экосистему [ 5].
Amorpha L. ( Fabaceae Juss.: Amorpheae Britains .) — род из 16 видов, произрастающих в Северной Америке [ 6 ]. Эти растения могут представлять собой кустарники, полукустарники или травянистые многолетние растения и встречаются в различных средах обитания, включая прибрежные коридоры, саванны и луга. Многие виды Amorpha имеют очень ограниченное распространение, а некоторые считаются находящимися под угрозой исчезновения [ 7 ].
Amorpha fruticosa L. (куст индиго) — многолетний листопадный кустарник, принадлежащий к семейству Fabaceae и произрастающий в юго-западной части Северной Америки [ 8 ]. Куст индиго был завезен в Европу как декоративное растение [ 5 ]. Его используют как лекарство для лечения ожогов и экземы [ 9 ]. В последние годы ему уделяется особое внимание из-за его биологической активности. Исследования показали, что это растение богато полифенолами и содержит биологически активные ингредиенты. Он также обладает противораковой, противовоспалительной и противомикробной активностью [ 10] .]. Куст индиго – растение, имеющее большую декоративную ценность и используемое при обустройстве городских ландшафтов и при охране склонов. Он может выжить в сухих почвах, но предпочитает берега рек и опушки затопленных лесов, где легко распространяется водой, поскольку его семенные коробочки плавучие [11 ] . Его высокая толерантность к различным климатическим условиям, а также отличная способность к размножению дают ему возможность с легкостью расти за пределами своего естественного распространения [ 12 ]. Сегодня он признан одним из наиболее инвазивных видов в Европе, оказывающим серьезное воздействие на местные экосистемы [ 11 ]. Это светолюбивое растение, конкурирующее за свет, образующее густые заросли, затмевающие местную флору, а это приводит к снижению биоразнообразия [ 11, 12 , 13 ]. Из-за ущерба, который он наносит природным экосистемам и водному хозяйству, следует немедленно принять меры по сокращению/контролю его популяции.
В Греции трансграничные реки, такие как Нестос, Аксиос и др., являются транспортными коридорами для чужеродных видов растений, которые расширяют свой ареал за счет воды [ 14 ]. Однако, помимо конкретного вида транспорта, в последние годы в Грецию были интродуцированы многие зарубежные виды растений, как намеренно (например, декоративные и лекарственные растения), так и непреднамеренно, используя различные способы интродукции [2 ] . Хотя число чужеродных видов велико, не все из них являются инвазивными. Из 343 чужеродных видов только 50 проявляют инвазионное поведение, и большинство из них имеют американское происхождение [ 15 ].
Нестос — трансграничная река Болгарии и Северной Греции. Берет начало от горы Рила на юге Болгарии и проходит между горными хребтами Аймос и Родопы. Его длина составляет 234 км, из них 130 км находится на территории Греции [ 16 ]. Прежде чем впасть в море, он простирается через равнину Хрисуполис и расширяется как дельтовая система с пресноводными озерами, образующими дельту Нестоса. В этой зоне существует приоритетная среда обитания 91E0 (Приложение I Директивы 92/43/EEC), в которой представлены два подтипа: подтип ольховых насаждений ( Alnus Glutinosa ) и подтип тополя белого ( Populus alba ) и вяза ( Ulmusminor ).) стоит. Первый подтип состоит из чистых насаждений ольхи, произрастающих на легких и умеренно легких почвах с очень хорошими физическими свойствами, которые можно охарактеризовать как Calcaric fluvisols. При этом уровень грунтовых вод относительно высокий (90–95 см). Этот подтип встречается между дамбами, местами вблизи берегов рек или в местах, удаленных от них на несколько десятков метров. Второй подтип составляет значительную часть тугайного леса и располагается за пределами дамб. Он состоит из насаждений белого тополя и вяза, которые растут на глубоких и умеренно легких почвах с хорошими физическими свойствами, принадлежащих к типу почв Eutric Fluvisol, без проблем с щелочностью и засоленностью. Уровень грунтовых вод низкий, но сильно колеблется [ 17 ].
Территория вдоль реки существенно изменилась со времен Второй мировой войны [ 18 ]. В 1945 году на этой территории преобладали леса и водно-болотные угодья. В 1960-е годы площадь сельскохозяйственных угодий увеличилась, что привело к уменьшению лесных площадей. Также произошло значительное сокращение площади водно-болотных угодий из-за их преобразования в пастбища. Однако, несмотря на сильное упадок природной экосистемы, в этом районе по-прежнему сохраняется самый обширный речной лес в Греции. Кроме того, равнина реки Нестос имеет важное экологическое значение из-за множества важных мест обитания. Он был классифицирован как водно-болотное угодье международного значения и включен в Рамсарскую конвенцию. Он также защищен Бернской конвенцией, директивами Европейской комиссии и законодательством Греции. Кроме того, он принадлежит к сети Natura 2000.19 ].
В Греции Amorpha fruticosa L. считается инвазивным видом, поскольку это растение способно распространяться на обширной территории. В настоящей работе изучено генетическое разнообразие популяций Amorpha fruticosa L., произрастающих вдоль реки Нестос. Наши цели заключались в том, чтобы (1) определить уровень генетической дифференциации, если она существует, между двумя берегами реки: западным и восточным; (2) оценить степень инбридинга в каждой популяции, а также эффективный размер популяции; и (3) обсудить последствия расширения конкретных видов в естественной экосистеме и, более конкретно, в популяциях местных видов в этом районе.

2. Материалы и методы

2.1. Растительный материал

Сбор образцов листьев проведен на 20 особях Amorpha fruticosa из 2 популяций района реки Нестос (ориентировочные координаты западной популяции A: X: 565671, Y: 4527927 и восточной популяции: X: 566918, Y: 4525481). Экстракцию ДНК из свежей хвои проводили с помощью набора Macherey Nagel Plant (Düren, Северный Рейн-Вестфалия, Германия) в соответствии с протоколом производителя.

2.2. Процедура ПФЛП

Всего 200 нг геномной ДНК фрагментировали расщеплением 4 ед. ферментов EcoRI и MseI при температуре 37°С в течение 3 часов. Расщепленные фрагменты ДНК затем объединяли с адаптерами EcoRI и MseI и полученную смесь лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 от New England Biolabs (Ипсвич, Массачусетс, США). Этот этап лигирования проводили при температуре 26°C в течение 3 часов. Полученную в результате этого процесса ДНК использовали в качестве первичной матрицы для анализа AFLP.
Для этапа преамплификации использовали пару праймеров на основе последовательностей адаптеров EcoRI и MseI с дополнительным селективным нуклеотидом на 3'-конце (EcoRI+A и MseI+C). ПЦР с предварительной амплификацией проводили в общем объеме 20 мкл, который содержал 1X буфер Kapa Taq, 0,2 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl 2., 30 нг каждого праймера (EcoRI+A и MseI+C), 1 единица ДНК-полимеразы Taq от Kapa Biosystems (расположена в Уилмингтоне, Массачусетс, США) и 5 ​​мкл разведенных фрагментов ДНК, полученных в результате реакции расщепления и лигирования. . Условия циклирования ПЦР были следующими: начальная денатурация при 95 °С в течение 30 с, затем 32 цикла денатурации при 95 °С в течение 30 с, отжиг при 56 °С в течение 30 с, удлинение при 72 °С в течение 1 мин. и заключительный этап удлинения при 72 ° C в течение 10 минут. Для подтверждения амплификации образец реакции объемом 5 мкл подвергали электрофорезу в агарозном геле, а оставшиеся 15 мкл разбавляли в 5 раз ТЕ-буфером.
Селективную амплификацию проводили в реакционных объемах объемом 10 мкл, состоящих из 3 мкл разбавленной преселективной матрицы, и с использованием тех же условий реакции, что и на стадии преселективной амплификации, за исключением использования 30 нг праймера MseI и 5 нг праймера EcoRI. за реакцию. Программа циклической селективной амплификации осуществлялась с использованием термоциклера BioRad (Hercules, Калифорния, США) по следующей схеме: начальный цикл денатурации при 95 °C в течение 30 с, отжиг при 65 °C в течение 30 с и удлинение при 95 °C в течение 30 с. 72 °С в течение 1 мин. За этим следовали двенадцать циклов денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг, начинающийся при 65°С в течение 30 с и уменьшающийся на 0,75°С в каждом цикле, и удлинение при 72°С в течение 1 мин. Наконец, двадцать три цикла денатурации при 95°С в течение 30 с, отжиг при 56°С в течение 30 с,
Смеси продуктов f-AFLP подвергали денатурации путем обработки их формамидом при температуре 94 °С в течение 2 мин. Впоследствии эти денатурированные смеси разделяли электрофорезом с использованием генетического анализатора ABI Prism 3730xl, который производится Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Использовали десять комбинаций селективных праймеров AFLP. Затем каждый отдельный гибрид исследовали для определения наличия или отсутствия конкретных фрагментов. Размер обнаруженных фрагментов определяли с использованием программы GeneMapper 4.0 вместе с внутренним стандартом, известным как GS 500 LIZ, который также был предоставлен Applied Biosystems (Уолтем, Массачусетс, США). Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров,20 ].

2.3. Индекс регенерации

Присутствие и плотность A. fruticosa оценивались в приоритетном местообитании 91E0* в районе Нестос на северо-востоке Греции ( рис. 1 ). Пятнадцать (15) участков, каждый площадью 706,86 м 2 , были выбраны случайным образом и равномерно размещены по всей территории обитания 91E0*. В дальнейшем был проведен анализ состава и структуры древесных пород на этих участках. A. fruticosa присутствовала на четырех участках из 15, из которых три располагались на западном берегу реки и один на восточном. У особей A. fruticosa измеряли высоту дерева (м), плотность (особей га -1 ) и индекс регенерации (IR) . IR рассчитывали путем умножения плотности A. fruticosa (на м2 ) по средней высоте A. fruticosa (см) и позволяет оценить степень регенерации [ 20 ].
Экология 04 00041 g001
Рисунок 1. Amorpha fruticosa , распространенная на приоритетном местообитании 91Ε0* в дельте Нестоса, на северо-востоке Греции.

2.4. Сбор данных и статистический анализ данных AFLP

Для преобразования информации о размере аллелей, полученной с помощью GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems, США), в двоичный формат использовался макрос AFLP Excel. Этот макрос присваивал значение «1» присутствующим фрагментам и «0» отсутствующим. Чтобы свести к минимуму влияние потенциальной гомоплазии размеров, подсчитывали и подвергали дополнительному изучению только согласованные фрагменты, попадающие в диапазон от 150 до 500 пар оснований [ 21 ]. Кроме того, GenAlex v6.0 [ 22 ] использовался для расчета таких параметров, как процент полиморфных полос (P), информационный индекс Шеннона (I) и генетическое разнообразие (He). GenAlex v6.0 также использовался для проведения анализа молекулярной дисперсии (AMOVA), а также для расчета генетических расстояний и анализа главных координат (PCoA).
Подробно, анализ главных координат (PCoA) представляет собой многомерный метод, который позволяет находить и отображать основные закономерности в многомерном наборе данных (например, множественных локусах и множественных образцах). Математика сложна, но, по сути, PCoA — это процесс, с помощью которого основные оси вариаций располагаются в многомерном наборе данных. Для многомерных наборов данных каждая последующая ось объясняет пропорционально меньшую часть общей вариации, так что при наличии отдельных групп первые две или три оси обычно выявляют большую часть разделения между ними. Предусмотрено четыре различных варианта: два основаны на преобразовании матрицы расстояний в ковариационную матрицу, а два работают непосредственно на основе входной матрицы расстояний. Матрица расстояний используется как пул для расчета распределения по осям [22 ].

2.5. Информация о среде обитания 91E0*

Местообитание 91E0* в дельте реки Нестос простирается на небольших высотах (<100 м над уровнем моря) с поверхностями от умеренного до плоского рельефа (уклон 0–10%) (выборка личных данных Коракаки Э. и Карецоса Г.). В его состав входят доминирующие виды деревьев, такие как Fraxinus excelsior L. и Alnus Glutinosa (L.) Gaertn., а также Fraxinus angustifolia Vahl, Salix alba L., Populus alba L., Pinus nigra JF Arnold, Juglans regia L., Cornus sanguinea. L., Ulmus major Mill. и Quercus robur subsp. pedunculiflora (К. Кох) Меницкого. Существует множество вьющихся растений (например,Periploca graeca L. и др.), а травянистый ярус неизменно включает множество видов (например, Aegopodium podagraria L., Hedera helix L., Lysimachia punctata L., Circaea lutetiana L., Arum maculatum L. и др.) (Solomou Выборка персональных данных А. и Карецоса Г.). Дельта Нестоса образована аллювиальными отложениями реки Нестос. Речные отложения состоят из аллювиальных отложений глин, песков и гравия, тогда как пойменные отложения состоят преимущественно из глин и песков [ 23 ].

3. Результаты

3.1. Генетические результаты

Семь комбинаций праймеров AFLP дали 313 локусов для двух популяций. По результатам AFLP, восточная популяция имела полиморфизм 83,39%, а западная — 83,07%. Средняя ожидаемая гетерозиготность (He) составляла 0,127, а западная популяция имела среднюю гетерозиготность немного выше (0,136), чем восточная (0,119). Параметры генетического разнообразия представлены в Таблице 1 вместе с эпигенетическими результатами.
Таблица 1. Среднее значение и стандартная ошибка (SE) для Na (количество аллелей), Ne (количество эффективных аллелей), I (информационный индекс Шеннона) и He (ожидаемая гетерозиготность).
AMOVA (анализ молекулярной дисперсии) определил 97% генетических вариаций внутри популяций и 3% только между популяциями ( рис. 2 ). Анализ основных координат объяснил 16,89% дисперсии ( рис. 3 ).
Экология 04 00041 g002
Рисунок 2. Анализ молекулярной дисперсии среди популяций и внутри них: дисперсия среди популяций составила 3%, а внутри - 97%. Генетическая вариация фрагментов AFLP, использованных для анализа AMOVA.
Экология 04 00041 g003
Рисунок 3. Анализ основных координат объяснил 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы в зависимости от происхождения популяций. На рисунке обозначена небольшая группировка двух популяций, полученная на основе матрицы генетических расстояний генотипов.

3.2. Плотность и индекс регенерации

На четырех участках было зарегистрировано в общей сложности 233 особи A. fruticosa , в результате чего средняя плотность составила 824,07 растений на гектар. Примечательно, что плотность A. fruticosa и индекс регенерации (IR) оказались выше у популяции, проживающей на западном берегу реки, по сравнению с восточным берегом реки. Однако стоит отметить, что средняя высота деревьев была выше на восточном берегу реки, как указано в Таблице 2 . В аллювиальном лесу наиболее широко распространено возобновление чужеродных видов A. fruticosa и A. negundo (личное сообщение Коракаки).
Таблица 2. Средняя высота, средняя плотность и средний индекс регенерации (IR).

4. Дискуссия

Сообщается, что ложное индиго ( Amorpha fruticosa L.) является неместным [ 15 ], и недавние наблюдения зафиксировали его присутствие на значительных территориях вдоль рек Ардас, Эврос и Нестос на северо-востоке Греции, что указывает на его завоз из соседней Болгарии. , возможно, через речной транспорт генетического материала. В прибрежных лесах реки Нестос на северо-востоке Греции A. fruticosa демонстрирует значительную динамику регенерации и, по-видимому, подавляет растительность в важных приоритетных местообитаниях.
В этом исследовании мы оценили генетическое разнообразие двух популяций с западного и восточного берегов реки Нестос, чтобы оценить, имеют ли они различия в генетических параметрах или имеют ли они схожие индексы генетического разнообразия. По оценкам локусов AFLP, гетерозиготность западной популяции была немного выше, но существенно не отличалась от восточной популяции. Более того, как показал анализ AMOVA, большая часть генетических вариаций наблюдалась внутри популяций (97%). Анализ основных координат объяснил лишь 16,89% общей изменчивости, и были сформулированы две небольшие группы по происхождению популяций. Главный вывод генетического анализа заключался в том, что западные и восточные популяции имеют общий генетический фонд, который поступает с водой через реку Нестос.
Что касается аналогичных исследований, авторы не обнаружили никаких упоминаний о генетическом разнообразии с использованием молекулярных маркеров растений A. fruticosa . Однако есть одно исследование [ 24 ], в котором они измерили 47 агрономических и морфологических признаков энергии биомассы. Результаты показали, что на все признаки повлияли образцы, и это ключ, который также может демонстрировать генетическое содержание, которое, вероятно, влияет на изменчивость. Кроме того, были проведены исследования экспрессии генов, связанных с засухой [ 25 ], фенольных компонентов [ 26 ], протеомного анализа симбиотических белков [ 27 ] и исследований рака [ 28 , 29] .]. Вышеупомянутые исследования с одной точки зрения указывают на значение A. fruticosa , хотя мы не можем исключить негативное воздействие, которое он оказывает на экосистемы из-за его быстрого распространения. Этот инвазивный вид может проникнуть в луговые сообщества и быстро превратить среду обитания в густые и однородные заросли. Он вытесняет местные растения и нарушает естественную сукцессию растений и биоразнообразие. Это представляет собой серьезную угрозу, поскольку подавляет местные виды деревьев в приоритетном аллювиальном лесу дельты Нестоса (91E0*). Кроме того, это ставит под угрозу выживание видов Emys orbcularis , Testudo Hermanni и Callimorpha Quadripunctaria *, поскольку они зависят от этих мест обитания.
Согласно нашим выводам, A. fruticosa более активно развивается на западном берегу реки Нестос, что представляет значительный риск для биоразнообразия и подавления местных видов деревьев в аллювиальных лесах региона Нестос. Таким образом, любые природоохранные меры и действия по управлению лесами, направленные на ограничение распространения A. fruticosa , должны быть приоритетными на этом берегу реки. Меры по сохранению необходимы для защиты и поддержания этой естественной среды обитания, которая представляет значительный интерес для сообщества. Действия также должны быть направлены на повышение осведомленности об угрозах, с которыми сталкиваются аллювиальные леса, и на обеспечение их долгосрочной защиты и сохранения. Этот результат ИК дает нам первое указание на то, что A. fruticosaбудет более обширным на западной стороне, и результат небольшой, но более высокой гетерозиготности согласуется с текущим результатом. С 2021 года Институт средиземноморских лесных экосистем (ELGO-DIMITRA) разрабатывает различные экспериментальные методы лечения, чтобы изучить возможные решения по ограничению распространения A. fruticosa .
Наконец, в этом исследовании мы обнаружили аналогичный генетический пул с восточного и западного берегов реки Нестос, который, вероятно, происходит из Болгарии. Будущие исследования должны также включать генетический анализ этих болгарских популяций. Считается необходимым продолжить исследования и изучение A. fruticosa в ближайшие годы, чтобы было более полное знание этого вида и его влияния на экосистему, чтобы затем можно было создать и создать систему управления этим видом. его преимущества можно использовать, не оказывая негативного воздействия на экосистему.

5. Выводы

Первое сообщение о генетическом разнообразии и распространении чужеродного вида Amorpha fruticosa L. было впервые использовано за рекой Нестос в Греции. Мы изучили две популяции, одну с западной стороны и одну с восточной стороны, с маркерами AFLP, и не обнаружили дифференциации между ними. Это указывает на то, что, вероятно, один генетический пул был передан через реку из Болгарии, и будущие исследования должны также охватывать болгарские популяции. Кроме того, проведенная первая оценка состояния регенерации также указывает на расширение вида. Это обязательный шаг для оценки и предложения мер управления с целью сохранения и ограничения распространения вида, который оказывает существенное негативное воздействие на среду обитания 91E0*.

Вклад автора

Концептуализация, EVA и EK; методология, EVA, EK, EM, ADS, GM и ГК; программное обеспечение, EVA, EM и EK; проверка, все; ресурсы, EVA и EK; курирование данных, EVA и EK; письмо — подготовка оригинального проекта, EVA, EK, EM и ADS; написание — просмотр и редактирование, все; надзор, EVA и EK; администрация проекта, ЭК; приобретение финансирования, Е.К. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Это исследование финансировалось проектом LIFE PRIMED, LIFE17 NAT/GR/000511, который софинансируется Греческим зеленым фондом (GRFU).

Заявление о доступности данных

Данные недоступны.

Конфликт интересов

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Рекомендации

  1. Ричардсон, DM; Пышек, П.; Рейманек, М.; Барбур, Миннесота; Панетта, Флорида; Уэст, К.Дж. Натурализация и вторжение чужеродных растений: концепции и определения. Дайверы. Распредел. 2000 , 6 , 93–107. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  2. Коракаки, ​​Э.; Легакис, А.; Кацаневакис, С.; Кулелис, П.; Аврамиду, Э.; Сулиоти, Н.; Петракис, П. Инвазивные чужеродные виды Греции. Обсервация инвазивных чужеродных видов. Проблемы вокруг света 2021 , 3 , 124–189. [ Академика Google ]
  3. Мияваки, С.; Вашитани, И. Инвазивные чужеродные виды растений в прибрежных районах Японии: вклад сельскохозяйственных сорняков, видов восстановления растительности и аквакультурных видов. Глоб. Окружающая среда. Рез.-англ. Эд. 2004 , 8 , 89–101. [ Академика Google ]
  4. Каллауэй, РМ; Ашехуг, Э.Т. Инвазивные растения против их новых и старых соседей: механизм экзотического вторжения. Наука 2000 , 290 , 521–523. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  5. Иванеску, Б.; Лунгу, К.; Власе, Л.; Градинару, AC; Тухилус, К. ВЭЖХ-анализ фенольных соединений, антиоксидантной и противомикробной активности Amorpha fruticosa L. Экстракты. Дж. Плант Дев. 2019 , 26 , 77. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  6. Штрауб, Южная Каролина; Извините, бакалавр; Уикли, А.С. Amorpha confusa , новое название старой Amorpha (Fabaceae: Amorpheae). Дж. Бот. Рез. Инст. Техас, 2009 г. , 151–155. [ Академика Google ]
  7. Штрауб, Южная Каролина; Дойл, Дж. Дж. Молекулярная филогенетика Amorpha (Fabaceae): оценка монофилии, видовых отношений и полиплоидного происхождения. Мол. Филогенетика Эвол. 2014 , 76 , 49–66. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  8. Лю, Дж.; Ван, ET; Chen, WX Разнообразные ризобии, связанные с древесными бобовыми культурами Wisteria sinensis , Cercis Racemosa и Amorpha fruticosa, выращиваемыми в умеренной зоне Китая. Сист. Прил. Микробиол. 2005 , 28 , 465–477. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  9. Китайский, П. Словарь китайской Materia Medica ; Китайская научно-техническая медицинская пресса: Пекин, Китай, 1997. [ Google Scholar ]
  10. Митчер, Луизиана; Парк, Ю.Х.; Альшамма, А.; Хадсон, ПБ; Хаас, Т. Аморфрутин a и b, бибензиловые противомикробные средства из Amorpha fruticosa . Фитохимия 1981 , 20 , 781–785. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  11. Крпан, АП; Томашич, Ж.; Башич Палкович, П. Биопотенциал индигобуша ( Amorpha fruticosa L.) – второй год исследования. Список Шумарского. 2011 , 135 , 103–112. [ Академика Google ]
  12. Кожухарова Е.; Матковский, А.; Возняк, Д.; Симеонова Р.; Найчов З.; Малайнер, К.; Мокан, А.; Набави, С.М.; Атанасов А.Г. Amorpha fruticosa – вредоносное инвазионное чужеродное растение в Европе или лекарственное растение от болезней обмена веществ? Передний. Фармакол. 2017 , 8 , 333. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  13. Сигетвари, К. Первые шаги по восстановлению пойменного луга после десятилетия доминирования инвазивного кустарника-трансформера Amorpha fruticosa L. Tiscia 2002 , 33 , 67–77. [ Академика Google ]
  14. Педашенко, Л.П.; Апостолова, И.И.; Васильев К.В. Невселенность Amorpha fruticosa в различных местообитаниях нижнего Дуная. Фитол. Балк. 2012 , 18 , 285–291. [ Академика Google ]
  15. Ариануцу, М.; Базос, И.; Делипетру, П.; Коккорис, Ю. Инопланетная флора Греции: таксономия, особенности жизни и предпочтения среды обитания. Биол. Вторжения 2010 , 12 , 3525–3549. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  16. Самарас, АГ; Коутитас, К.Г. Моделирование воздействия на прибрежную морфологию управления водными ресурсами в трансграничных речных бассейнах: пример реки Нестос. Менеджер. Окружающая среда. Квал. Межд. Дж. 2008 , 19 , 455–466. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  17. Декамп, Х.; Декамп, О. Средиземноморские прибрежные леса ; Сохранение водно-болотных угодий Средиземноморья; Тур дю Валат: Арль, Франция, 2001 г. [ Google Scholar ]
  18. Маллинис, Г.; Эмманолудис, Д.; Яннакопулос, В.; Марис, Ф.; Куциас, Н. Картирование и интерпретация исторических изменений растительного покрова/землепользования на участке «Натура 2000» с использованием данных наблюдений за Землей: пример дельты Нестоса, Греция. Прил. геогр. 2011 , 31 , 312–320. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  19. Дафис, С.; Папастергиаду, Э.; Георгиу, К.; Бабалонас, Д.; Георгиадис, Т.; Папагеоргиу, М.; Лазариду, Т.; Циаусси, В. Греческий проект «среды обитания» Natura 2000: Обзор. Пожизненный контракт B4-32000/94/756 ; Комиссия Европейских Сообществ, Музей естественной истории Гуландриса, Центр греческих биотопов и водно-болотных угодий; Springer: Берлин/Гейдельберг, Германия, 1996. [ Google Scholar ]
  20. Бьянки, Л.; Пачи, М. Эволюционная динамика и тосканское обучение: Sintesi di quarant'anni di richerche. Для.-Ж. Сильвик. Для. Экол. 2008 , 5 , 122. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
  21. Векеманс, X.; Боуэнс, Т.; Лемэр, М.; Ролдан-Руис, И. Данные маркеров амплифицированного полиморфизма длин фрагментов (AFLP) указывают на гомоплазию по размеру и взаимосвязь между степенью гомоплазии и размером фрагмента. Мол. Экол. 2002 , 11 , 139–151. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  22. Пикалл, РОД; Смаус, ЧП Genalex 6: Генетический анализ в Excel. Программное обеспечение популяционной генетики для обучения и исследований. Мол. Экол. Примечания 2006 , 6 , 288–295. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  23. Тафтсоглу, М.; Валканиотис, С.; Папатанасиу, Г.; Климис, Н.; Докас, И. Подробная карта подверженности разжижению дельты реки Нестос, Фракия, Греция, основанная на поверхностной геологии и геоморфологии. Geosciences 2022 , 12 , 361. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  24. ДеХаан, Л.; Эльке, Н.; Шиффер, К.; Вайз, Д.; ДеХаан, Р. Оценка разнообразия североамериканских образцов ложного индиго ( Amorpha fruticosa L.) для корма и биомассы. Жене. Ресурс. Кроп Эвол. 2006 , 53 , 1463–1476. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  25. Ли, М.; Лю, З.; Лю, К.; Чжу, Ф.; Ван, К.; Ван, З.; Ли, Х.; Лан, X.; Гуан, К. Засухоустойчивость табака, сверхэкспрессирующего ген afnac1 Amorpha fruticosa Linn. Передний. Наука о растениях. 2022 , 13 , 980171. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  26. Дат, Северная Каролина; Ли, Дж.-Х.; Лук-порей.; Хонг, Ю.-С.; Ким, Ю.Х.; Ли, Дж. Дж. Фенольные компоненты Amorpha fruticosa , которые ингибируют активацию nf-κb и связанную с ней экспрессию генов. Дж. Нэт. Прод. 2008 , 71 , 1696–1700. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  27. Песня, Ф.; Ци, Д.; Лю, X.; Конг, X.; Гао, Ю.; Чжоу, З.; Ву, К. Протеомный анализ симбиотических белков Glomus mosseae и Amorpha fruticosa . наук. Rep. 2015 , 5 , 18031. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  28. Тодорова Т.; Бояджиев, К.; Шкондров А.; Пырванова П.; Димитрова, М.; Ионкова И.; Крастева И.; Кожухарова Е.; Чанкова, С. Скрининг экстрактов Amorpha fruticosa и Ailanthus altissima на генотоксичность/антигенотоксичность, мутагенность/антимутагенность и канцерогенность/антиканцерогенность. БиоРиск 2022 , 17 , 201–212. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  29. Цветкович, Д.М.; Йованкич, СП; Милутинович, М.Г.; Никодиевич, Д.Д.; Грбович, Ф.Дж.; Чирич, АР; Топузович, доктор медицинских наук; Маркович, С.Д. Противоинвазивная активность Robinia pseudoacacia L. и Amorpha fruticosa L. На клеточной линии рака молочной железы mda-mb-231. Биология 2019 , 74 , 915–928. [ Академия Google ] [ CrossRef ]

Категория: Блог
Просмотров: 481

Абстрактный

Здесь мы сообщаем об расширении химического пространства, доступного для хитина, доступного через биогенные N -платформы 3A5AF, M4A2C и ди-HAF. Биологически активные гетероароматические соединения фуро[3,2- d ]пиримидин-4-он и фуро[3,2- d ]пиримидин-4-амин могут быть селективно доступны из 3A5AF и M4A2C соответственно. Синтон ди-HAF хирального пула является жизнеспособным субстратом для перегруппировки Ахматовича, обеспечивая упрощенный доступ к 2-аминосахарам, имеющим универсальную гидроксиметильную группу в положении C5.
Ключевые слова:
хитин ; ракообразное ; отходы для оценки ; биомасса ; Габеровская независимость ; азотистые гетероциклы ; аминосахар ; платформенные химикаты ; хиральный пул ; фуран
 

 

1. Введение

Атом азота (N) в химических веществах тонкого и массового производства получается из товарного аммиака: основного химического вещества, производимого в огромных масштабах с использованием энергоемкого процесса Габера [ 1 , 2 , 3 , 4 ]. Чтобы уменьшить углеродный след азоторганических химикатов, их производство можно проводить независимым от Габера способом, получая азот из огромных количеств биогенного азота, доступного на Земле, причем одним из доступных источников является биополимер хитин [5 , 6 ] . Действительно, несколько сообщений, описывающих превращение хитина (или его мономера, N -ацетил- d -глюкозамина; GlcNAc) в биогенный Nпоявились -платформы [ 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 ], включающие функционально богатые фураны 3-ацетамидо-5-фурфуриловый альдегид (3A5F) [ 13 ], 3-ацетамидо-5-ацетилфуран (3A5AF) [ 14 ] и дигидроксиэтилацетамидофуран (ди-HAF) [ 15 ] ( Схема 1 ).
Химия 05 00135 sch001
Схема 1. Избранные N -платформы, доступные из хитина.
За последние несколько лет мы продемонстрировали полезность 3A5AF в независимом от Габера синтезе природного продукта проксимицина А [ 16 ], 3-азафуранов [ 17 , 18 ], новых гетероароматических каркасов [ 19 ], 2-аминосахаров [ 20 ]. ] и в программе синтеза, ориентированного на разнообразие (DOS), которая предоставила ряд структурно различных N -гетероциклов [ 21 ]. Недавно мы продемонстрировали, что присущая хитину хиральность может быть перенесена на природный продукт эпи -лептосфаэрин А через платформу хирального пула di-HAF [ 22 ]. Другие исследовательские группы показали, что 3A5AF (и производные) [ 23 ,24 ] и ди-HAF [ 25 ] могут служить диенами в реакции Дильса-Альдера, в то время как 3A5F показал значительные перспективы в качестве химического вещества-платформы, в том числе в качестве средства биоконъюгации для модификации N -цистеина [ 13 ].
Наши постоянные усилия в этой области сосредоточены на использовании вышеупомянутых N -платформ для доступа к химическим промежуточным продуктам, используемым в фармацевтическом и/или агрохимическом секторах. Одной из мишеней, которая соответствует этим критериям, является фуро[3,2- d ]пиримидин-4-амин 1 , гетероароматический каркас, обнаруженный в C -нуклеозидном антибиотике пирролозине [ 26 , 27 , 28 ] и используемый во множестве программ медицинской химии против широкий спектр мишеней, включая тирозинкиназы селезенки [ 29 ], рецептор, связанный с G-белком 119 [ 30 ], киназу p110δ PI3 [ 31]] и фосфоинозитидкиназы FYVE-типа, содержащие палец [ 32 ]. Мы предполагали, что гетероароматическая кольцевая система 1 может быть доступна из 3A5AF посредством цианирования по C2 с последующим гидролизом ацетамида с образованием аминонитрила 2 с последующим гетероаннелированием формамидином [ 27 , 28 , 33 , 34 ] ( схема 2 ). Хотя только один атом азота в 1 получен из хитина, нашей целью было получить другие атомы N из N -соединений, присутствующих в природе ( q.v ).
Химия 05 00135 sch002
Схема 2. Предлагаемый синтез фуро[3,2- d ]пиримидин-4-амина 1 .

2. Материалы и методы

2.1. Общая информация

Коммерчески доступные исходные материалы, реагенты и растворители использовали в том виде, в котором они были получены, если не указано иное. В случае применения безводных условий реакцию проводили в атмосфере сухого азота в высушенной в печи (100 °C) стеклянной посуде, а растворитель сушили, пропуская через колонку с активированным оксидом алюминия в атмосфере азота с использованием системы очистки растворителя LC Technology. . Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили с использованием пластин кремнезема F254 толщиной 0,2 мм с последующей визуализацией УФ-облучением при 254 нм и 366 нм и окрашиванием этанольным раствором ванилина. Колоночную флэш-хроматографию проводили с использованием силикагеля 63-100 мкм. Температуры плавления определялись на аппарате Кофлера (John Morris, Новая Зеландия) и не корректировались. Масс-спектры высокого разрешения записаны на масс-спектрометре Bruker micrOTOF Q (Массачусетс, США), работающем в режиме положительных ионов. Для генерации ионов использовался стандартный источник электрораспыления (ESI). Инструмент эксплуатировался в г.м / з 50−1000 дальность. Инфракрасные (ИК) спектры записывали с помощью FTIR-спектрометра PerkinElmer (Массачусетс, США) с установленной универсальной приставкой ослабленного полного отражения (НПВО). Максимумы поглощения выражали в виде волнового числа (см -1 ). Спектры ЯМР записывали при комнатной температуре в растворах CDCl 3 , (CD 3 ) 2 SO или (CD 3 ) 2 CO на ЯМР-спектрометре Bruker (Массачусетс, США), работающем на частоте 400 МГц для ядер 1 H и 100 МГц для ядер 1 H. 13Ядра С. Все химические сдвиги выражались в частях на миллион (м.д.) и измерялись относительно протиевого растворителя, в котором анализировался образец: CDCl 3 ( 7,26 м.д. для 1 Н-ЯМР и δ 77,16 м.д. для 13 С-ЯМР), (CD 3 ) 2 SO ( δ 2,50 м.д. для 1 Н ЯМР и δ 39,52 м.д. для 13 С ЯМР) или (CD 3 ) 2 CO ( δ 2,05 м.д. для 1 Н ЯМР и δ 29,84 м.д. для 13 С ЯМР). Константы связи, Дж, указываются в герцах [Гц], где это применимо. Множественность обозначается как «s» (синглет), «d» (дуплет) и «br s» (широкий синглет). Рентгеноструктурные измерения монокристаллов проводили на монокристаллическом дифрактометре Rigaku Oxford Diffraction XtaLAB-Synergy-S (Токио, Япония) с гибридным пиксельным детектором PILATUS 200K с использованием Cu Kα-излучения (λ = 1,54184 Å). Данные обрабатывались с помощью программных пакетов SHELX2018-3 и Olex2 [ 35 , 36 , 37 ]. Все неводородные атомы уточнены анизотропно. Атомы водорода вводились в расчетные положения или располагались непосредственно и либо уточнялись с помощью модели наездника, либо без ограничений. Меркурий 2020.3.1 [ 38] использовался для визуализации молекулярной структуры. Рост кристаллов для целей рентгеновского кристаллографического анализа достигался с использованием медленного испарения или медленной диффузии пара. Все остальные соответствующие данные содержатся в этой статье и дополнительных материалах .

2.1.1. 2-Гидроксиимино-3-ацетамидо-5-ацетилфуран ( 4 )

К раствору 2-формилфурана 3 [ 18 ] ( 488 мг, 2,5 ммоль) в воде (10 мл) по каплям добавляли раствор гидрохлорида гидроксиламина (195 мг, 2,8 ммоль) и карбоната натрия (148 мг, 1,4 ммоль) в воде (10 мл). метанол (25 мл) при 0°С. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, затем концентрировали в вакууме, разбавляли этилацетатом (80 мл) и промывали водой (40 мл) и солевым раствором (40 мл). Органический слой сушили над Na 2 SO 4 , фильтровали и концентрировали в вакууме. Указанное в заголовке соединение (489 мг, 2,3 ммоль, 93%; д.р. 10:1) использовали на следующей стадии без какой-либо очистки.

2.1.2. 2-Циано-3-ацетамидо-5-ацетилфуран ( 5 )

Раствор оксима 4 (250 мг, 1,2 ммоль) в уксусном ангидриде (5 мл) перемешивали при 50 °С в течение 16 часов. Реакционную смесь концентрировали в вакууме с получением ацетоксииминофурана, который растворяли в ацетонитриле (5 мл). Добавляли триэтиламин (0,50 мл, 3,6 ммоль) и раствор перемешивали при 50°C в течение 2,5 часов. Раствор концентрировали в вакууме и очищали флэш-хроматографией на колонке с силикагелем, элюируя смесью этилацетат-петролейный эфир (2:3), с получением указанного в заголовке соединения (196 мг, 1,0 ммоль , 85%) в виде желтого твердого вещества; т. пл. 126,0–127,5 °С; HRMS [ESI, (M + Na) + ]: вычислено. для [C 9 H 8 N 2 O 3 + Na] + 215,0433, найдено 215,0427𝜈�макс /см -1 (ATR) 3286, 3236, 3088, 2227, 1690, 1559, 1528, 1366, 1276, 1223, 1141, 928; 1 H ЯМР (400 МГц, ацетон- d 6 ): δ 9,86 (1 H, шир. с, NH), 7,67 (1 H, с, ArH), 2,50 (3 H, с, Me), 2,17 (3 H, с, Я); ЯМР 13 С (100 МГц, ацетон- d 6 ): δ 186,7 (С), 169,2 (С), 154,4 (С), 136,8 (С), 111,7 (СН), 111,4 (С), 26,3 (Ме), 23,3 (Me), 1 × C не наблюдалось.

2.1.3. 5-Ацетил-3-амино-2-карбоксамидофуран ( 6 )

К раствору 2-цианофурана 5 (50 мг, 0,26 ммоль) в сухом метаноле (0,6 мл) добавляли раствор HCl в диоксане (4 М, 0,6 мл) при 0 °С. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 10 минут, гасили насыщенным раствором NaHCO 3 (15 мл), а затем экстрагировали этилацетатом (3 × 15 мл). Органический слой сушили безводным Na 2 SO 4 , фильтровали и концентрировали в вакууме. Указанное в заголовке соединение (44 мг, 0,26 ммоль, 100%) получали в виде желтого твердого вещества, которое использовали на следующей стадии без какой-либо очистки; т. пл. 192,5–193,5 °С; HRMS [ESI, (M + Na) + ]: вычислено. для [C 7 H 8 N 2 O 3 + Na] +191.0427, найдено 191.0429;𝜈�макс /см -1 (ATR) 3427, 3352, 3152, 1648, 1610, 1570, 1359, 1319, 1194, 940, 775; 1 H ЯМР (400 МГц, ДМСО- d 6 ): δ 7,30 (2 H, шир. с, NH 2 ), 6,86 (1 H, с, ArH), 5,47 (2 H, с, NH 2 ), 2,43 (3 Ч, с, Ме); ЯМР 13 С (100 МГц, ДМСО- d 6 ): δ 187,3 (С), 162,0 (С), 149,3 (С), 141,4 (С), 129,0 (С), 110,2 (СН), 25,8 (Ме).

2.1.4. 6-Ацетилфуро[3,2-d]пиримидин-4-он ( 7 )

Добавляли раствор 2-карбоксамидофурана 6 (20 мг, 0,12 ммоль) в этаноле (4 мл), ацетат формамидина (125 мг, 1,2 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 7 часов. Раствор концентрировали в вакууме, разбавляли этилацетатом (20 мл) и промывали насыщенным раствором Na 2 CO 3 (10 мл) и солевым раствором (10 мл). Органический слой сушили безводным Na 2 SO 4 , фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле, элюируя этилацетатом, с получением указанного в заголовке соединения (7,7 мг, 0,043 ммоль, 36%) в виде желтого масла; HRMS [ESI, (M + Na) + ]: вычислено. для [C 8 H 6 N2 O 3 + Na] + 201,0271, найдено 201,0271; 1 H ЯМР (400 МГц, ДМСО- d 6 ): δ 12,83 (1 H, шир. с, NH), 8,14 (1 H, с, ArH), 7,84 (1 H, с, ArH), 2,57 (3 H, с, Я); ЯМР 13 С (100 МГц, ДМСО- d 6 ): δ 187,7 (С), 154,5 (С), 152,1 (С), 147,3 (С), 147,1 (СН), 139,7 (С), 113,6 (СН), 26,5 (Мне).

2.1.5. Метил 4-ацетамидо-5-формилфуран-2-карбоксилат ( 8 )

Раствор фосфорилхлорида (0,28 мл, 3,0 ммоль) добавляли в сухом диметилформамиде (2,0 мл) при 0°C по каплям к раствору M4A2C [ 16 ] (366 мг, 2,0 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 часов. Добавляли воду (10 мл) при 0°C и смесь перемешивали еще 10 минут. Водную фазу нейтрализовали NaHCO 3 и экстрагировали этилацетатом (3 × 30 мл), сушили безводным Na 2 SO 4 , фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле, элюируя смесью этилацетат-петролейный эфир (1:1), с получением указанного в заголовке соединения.(262 мг, 1,2 ммоль, 62%) в виде желтого твердого вещества; т. пл. 175,0–176,5 °С; HRMS [ESI, (M + Na) + ]: вычислено. для [C 9 H 9 NO 5 + Na] + 234,0373 найдено 234,0368;𝜈�макс /см -1 (ATR) 3341, 3197, 1754, 1697, 1667, 1590, 1434, 1329, 1219, 1199, 984, 792, 769, 741; 1 H ЯМР (400 МГц, ацетон- d 6 ) δ 9.87 (1 H, с, CH), 9.52 (1 H, шир. с, NH), 7.93 (1 H, с, ArH), 3.93 (3 H, с , Me), 2,24 (3 H, с, Me); ЯМР 13 С (100 МГц, ацетон- d 6 ) δ 181,3 (С), 169,8 (С), 158,8 (С), 147,2 (С), 140,7 (С), 135,0 (С), 113,3 (СН), 52,9 ( Я), 23,9 (Я).

2.1.6. Метил 4-ацетамидо-5-[(гидроксиимино)метил]фуран-2-карбоксилат ( 9 )

К раствору 8 (211 мг, 1,0 ммоль) в метаноле (8 мл) по каплям добавляли раствор гидрохлорида гидроксиламина (83 мг, 1,2 ммоль) и карбоната натрия (64 мг, 0,6 ммоль) в воде (4 мл) при комнатная температура. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Метанол удаляли в вакууме и реакционную смесь разбавляли этилацетатом (40 мл), а затем промывали водой (20 мл) и солевым раствором (20 мл). Водную фазу экстрагировали этилацетатом (40 мл), объединенные органические фазы сушили безводным Na 2 SO 4 , фильтровали и концентрировали в вакууме. Заглавное соединение (224 мг, 0,99 ммоль, 99%, др.10:1) получали в виде желтого твердого вещества, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

2.1.7. Метил 4-ацетамидо-5-цианофуран-2-карбоксилат ( 10 )

Раствор оксима 9 (226 мг, 1 ммоль) в уксусном ангидриде (3 мл) перемешивали при 70 °С в течение 3 часов. После образования ацетоксииминофурана уксусный ангидрид концентрировали в вакууме. К остатку добавляли ацетонитрил (4 мл) и триэтиламин (0,3 мл, 2 ммоль) и полученный раствор перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 3 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и очищали флэш-хроматографией на силикагеле, элюируя смесью этилацетат-петролейный эфир (1:1), с получением указанного в заголовке соединения (181 мг , 0,87 ммоль, 87%) в виде желтого твердого вещества; т. пл. 219,5–220,5 °С; HRMS [ESI, (M + Na) + ]: вычислено. для [C 9 H 8 N 2 O 4 + Na] +231.0376, найдено 231.0376;𝜈�макс /см -1 (ATR) 3285, 3087, 2229, 1737, 1696, 1533, 1320, 1226, 1149, 985, 815, 769; 1 H ЯМР (400 МГц, ДМСО- d 6 ): δ 10,82 (1 H, с, NH), 7,41 (1 H, с, ArH), 3,86 (3 H, с, Me), 2,10 (3 H, с , Мне); ЯМР 13 С (100 МГц, ДМСО- d 6 ): δ 168,7 (С), 156,9 (С), 145,8 (С), 134,6 (С), 116,1 (С), 112,2 (СН), 111,0 (С), 52,7 (Я), 22,9 (Я).

2.1.8. Метил 4-амино-5-цианофуран-2-карбоксилат ( 11 )

К раствору 10 (62 мг, 0,30 ммоль) в сухом метаноле (3 мл) при 0°C добавляли соляную кислоту (4 М в диоксане, 0,2 мл). Раствор перемешивали при 40°С в течение 6 часов. Реакционную смесь нейтрализовали твердым NaHCO 3 при 0°C с последующим добавлением этилацетата (15 мл) и воды (15 мл). Слои разделяли, водную фазу экстрагировали этилацетатом (2 × 15 мл). Объединенные органические фазы сушили над Na 2 SO 4 , фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенную смесь очищали флэш-хроматографией на силикагеле, элюируя смесью этилацетат-петролейный эфир (1:1), с получением указанного в заголовке соединения ( 43 мг, 0,26 ммоль, 86%) в виде желтого твердого вещества; т. пл. 165,0–166,0 °С; HRMS [ESI, (M + Na)+ ]: расч. для [C 7 H 6 N 2 O 3 + Na] + 189,0271, найдено 189,0270;𝜈�макс /см -1 (ATR) 3430, 3343, 3232, 2210, 1720, 1607, 1329, 1224, 1176, 765; 1 H ЯМР (400 МГц, ДМСО- d 6 ): δ 6,85 (1 H, с, ArH), 6,17 (2 H, шир. с, NH 2 ), 3,81 (3 H, с, Me); ЯМР 13 С (100 МГц, ДМСО- d 6 ): δ 157,2 (С), 147,0 (С), 145,8 (С), 112,7 (С), 110,8 (СН), 109,1 (С), 52,4 (Ме).

2.1.9. Метил 4-аминофуро[3,2-d]пиримидин-6-карбоксилат ( 12 )

К раствору 4-амино-5-цианофурана 11 (37 мг, 0,22 ммоль) в уксусной кислоте (0,2 мл) добавляли ацетат формамидина (70 мг, 0,69 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 5 ч. . Раствор разбавляли этилацетатом (20 мл), промывали рассолом (10 мл) и насыщали NaHCO 3 (10 мл). Водный слой экстрагировали этилацетатом (2×10 мл), объединенные органические слои сушили над Na 2 SO 4 , фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле, элюируя смесью этилацетат-петролейный эфир (7:3), с получением указанного в заголовке соединения (23 мг, 0,12 ммоль, 54%) в виде бесцветного твердого вещества; т. пл. 218°С (разл.); HRMS [ESI, (M + H) +]: расч. для [C 8 H 7 N 3 O 3 + H] + 194,0560 найдено 194,0564;𝜈�макс /см -1 (ATR) 3434, 3284, 3008, 2960, 1732, 1660, 1301, 1203, 1094, 969, 761; 1 H ЯМР (400 МГц, ДМСО- d 6 ): δ 8,31 (1 H, с, ArH), 7,71 (2 H, шир. с, NH 2 ), 7,67 (1 H, с, ArH), 3,92 (3 H , с, Я); ЯМР 13 С (100 МГц, ДМСО- d 6 ): δ 158,6 (С), 154,5 (СН), 150,4 (С), 148,2 (С), 147,3 (С), 135,4 (С), 113,6 (СН), 52,6 (Мне).

2.1.10. ( R )- N -(5-(2-(( трет- Бутилдиметилсилил)окси)-1-гидроксиэтил)фуран-3-ил)ацетамид ( 15 )

К раствору ди-ГАФ [ 15 ] (55 мг, 0,297 ммоль) в ацетонитриле (3,5 мл) добавляли имидазол (80,9 мг, 1,19 ммоль, 4 экв.) с трет- бутилдиметилсилилхлоридом (42,5 мг, 0,282 ммоль, 0,95 экв.) при комнатной температуре. Реакционную смесь нагревали до 40°С в течение 30 минут и затем концентрировали в вакууме. Остаток очищали флэш-хроматографией, элюируя петролейным эфиром ацетона (5:1), с получением указанного в заголовке соединения (51 мг, 0,170 ммоль, 58%), которое было включено в неразделимую смесь вместе со своим региоизомером (95:5). ; т. пл. 58,6–59,8 °С; HRMS (ESI) m / z [M + Na] + , рассчитано для C 14 H 25 NO 4SiNa 322.1445, найдено 322.1435;𝜈�макс /см -1 (ATR) 3279, 2929, 2857, 1659, 1569, 1463, 1378, 1254, 1119, 1071, 837, 779; 1 H ЯМР (400 МГц, (CD 3 ) 2 CO): δ 9,18 (1 H, шир. с, NH), 7,89 (1 H, с, CH), 6,28 (1 H, с, CH), 4,60 (1 Н, к, J 5,5, СН), 4,35 (1 Н, д, J 5,5, ОН), 3,83 (2 Н, дк, J 5,5, 6,4, СН 2 ), 2,02 (3 Н, с, Ас), 0,87 (9 H, с, (Me) 3 ), 0,05 (3 H, с, Me), 0,04 (3 H, с, Me); ЯМР 13 С (100 МГц, (CD 3 ) 2 CO): δ 162,8 (С), 155,0 (С), 131,2 (СН), 126,7 (С), 102,3 (СН), 69,3 (СН), 67,0 (СН 2), 26,2 (3 × Me), 23,0 (CO Me ), 18,8 (C), -5,2 (Me), -5,3 (Me).

2.1.11. N -((6 R )-6-((( трет- Бутилдиметилсилил)окси)метил)-2-гидрокси-5-оксо-5,6-дигидро-2Н-пиран-3-ил)ацетамид ( 16 )

К раствору 15 (150 мг, 0,501 ммоль) в дихлорметане-метаноле (12 мл: 3 мл) при 0°C добавляли м -CPBA (77%, 123,5 мг, 0,551 ммоль, 1,1 экв.) и проводили реакцию смесь перемешивали при 0°C в течение 2 часов. К раствору добавляли Na 2 CO 3 (15 мл) и перемешивали в течение 30 минут. К реакционной смеси добавляли насыщенный раствор NaHCO 3 (15 мл) и перемешивали еще 30 мин. Смесь экстрагировали этилацетатом (200 мл), промывали холодным Na 2 CO 3 -NaHCO 3 (1:1, 4 × 50 мл), холодным рассолом (2 × 30 мл), сушили (Na 2 SO 4), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле, элюируя петролейным эфиром этилацетата (1:1), с получением указанного в заголовке соединения (130 мг, 0,412 ммоль, 82%, др. 1:0,6) в виде бесцветного твердого вещества; т. пл. 145,8–146,8 °С; HRMS (ESI) m/z [M + Na] + , рассчитано для C 14 H 25 NO 5 SiNa 338,1394, обнаружено 338,1385;𝜈�макс /см -1 (ATR) 3290, 2930, 2858, 1719, 1642, 1628, 1518, 1472, 1369, 1228, 1205, 1121, 1043, 958, 872, 825, 780, 729, 708 1 H ЯМР ( 400 МГц, (CD 3 ) 2 CO) Основной диастереомер: δ 9,21 (1 H, шир. с, NH), 6,79 (1 H, с, CH), 5,60 (1 H, с, CH), 4,41 (1 H, q). , J 2,6, CH), 4,00 (2 H, qd, J 4,5, 2,5 CH 2 ), 2,13 (3 H, с, Ac), 0,86 (9 H, с, (Me) 3 ), 0,05 (3 H, с, Me), 0,03 (3 H, с, Me); 13 С ЯМР (100 МГц, (CD 3 ) 2 CO) 195,2 (С), 171,0 (С), 153,5 (С), 108,3 (СН), 89,2 (СН), 76,0 (СН), 64,1 (СН 2 ) , 26,2 ((Я)3 ), 24,6 (Ac), 18,90 ( C (Me) 3 ), -5,1 (SiMe), -5,2 (SiMe); Минорный диастереомер: (400 МГц, (CD 3 ) 2 CO) δ 8,93 (1 H, шир. с, NH), 6,91 (1 H, с, CH), 5,48 (1 H, с, CH), 4,21 (1 H , дд, J 2,8, CH), 4,00 (2 H, qd, J 4,4, 2,7, CH 2 ), 2,17 (3 H, с, Ac), 0,87 (9 H, с, (Me) 3 ), 0,08 ( 3 H, с, Me), 0,05 (3 H, с, Me); ЯМР 13 С (100 МГц, (CD 3 ) 2 CO): δ 194,8 (С), 171,1 (С), 154,3 (С), 109,0 (СН), 89,6 (СН), 80,6 (СН), 64,8 (СН 2 ), 26,1 ((Me) 3 ), 24,7 (Ac), 18,87 (C (Me) 3 ), -5,29 (SiMe), -5,34 (SiMe).

2.1.12. ( R )- N -(6-((( трет- Бутилдиметилсилил)окси)метил)-2,5-диоксо-5,6-дигидро-2 H -пиран-3-ил)ацетамид ( 17 )

К перемешиваемой суспензии целита (1 г) и хлорхромата пиридиния (502 мг, 2,33 ммоль, 2 экв.) в сухом дихлорметане (20 мл) добавляли 16 (367 мг, 1,16 ммоль) одной порцией при 0°C. Смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 5 часов. Смесь фильтровали через слой целита и концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией на силикагеле, элюируя петролейным эфиром этилацетата (2:1), с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного твердого вещества (241 мг, 0,770 ммоль, 66%), т. пл. 112–113,6 °С. ;[ 𝛼 ]23𝐷�Д23+56,0 ( с 0,1, CH 2 Cl 2 ); HRMS (ESI) m / z [M + Na] + , рассчитано для C 14 H 23 NO 5 SiNa 336,1238, найдено 336,1240;𝜈�макс /см -1 (ATR) 3302, 2957, 2930, 2884, 2858, 1708, 1662, 1626, 1485, 1378, 1332, 1299, 1250, 1209, 1109, 1075, 1022, 997, 918, 879, 836, 778, 733; 1 H ЯМР (400 МГц, CDCl 3 ): δ 8,30 (1 H, шир. с, NH), 7,63 (1 H, с, CH), 4,88 (1 H, дд, J 1,7, CH), 4,03 (2 H , dq, CH 2 ), 2,24 (3 H, с, Ac), 0,78 (9 H, с, C(Me) 3 , 0,00 (3 H, с, Si-Me), -0,02 (3 H, с, Si-Me); 13 С ЯМР (100 МГц, CDCl 3 ) δ 192,5 (С), 169,4 (С), 160,2 (С), 138,3 (С), 117,2 (СН), 85,1 (СН), 64,7 (СН 2 ) . ), 25,6 (С Ме 3), 25,0 (Ас), 18,1 (С), -5,6 (Si-Me), -5,7 (Si-Me).

2.1.13. N -((5R , 6R ) -6-((( трет- Бутилдиметилсилил)окси)метил)-5-гидрокси-2-оксо-5,6-дигидро-2Н-пиран-3-ил)ацетамид ( 18 )

Раствор 17 (120 мг, 0,382 ммоль) в дихлорметан-метаноле (1,8:2,6 мл) охлаждали до -78 °C и добавляли трихлорид церия (4,7 мг, 0,0191, 5 моль%), а затем боргидрид натрия (22 мг, 0,574 ммоль, 1,5 экв.). Смесь перемешивали при -78°C в течение 3 часов, а затем экстрагировали этилацетатом (80 мл). Органический слой промывали водой (2×20 мл) и рассолом (20 мл), затем сушили (Na 2 SO 4 ), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали флэш-хроматографией на колонке с силикагелем, элюируя петролейным эфиром этилацетата (3:1), с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного твердого вещества (д.р. 93:7) (100 мг, 0,317 ммоль, 83%). т. пл. 144,8–146,0 °С; HRMS (ESI) м / з[M+Na] + , рассчитано для C 14 H 25 NO 5 SiNa 338,1394, найдено 338,1394;𝜈�макс /см -1 (ATR) 3322, 2955, 2930, 2858, 1725, 1671, 1552, 1472, 1384, 1340, 1242, 1191, 1123, 1087, 1006, 974, 941, 895, 835, 77 6, 745, 668; 1 H ЯМР (400 МГц, CDCl 3 ). Основной диастереомер: δ 7,83 (1 H, с, NH), 7,65 (1 H, д, J 6,8, CH), 4,54 (1 H, дд, J 2,5, CH), 4,54 (1 H, дд, J 2,5, CH), 4,41 (1 H, дк, J 2,5, 1,1, CH), 4,03 (2 H, дк, J 6,5, 5,3, CH 2 ), 2,14 (3 H, с, Ac), 0,91 (9 H, с, C( Me) 3 ), 0,121 (3 H, с, Si-Me), 0,117 (3 H, с, Si-Me), OH не наблюдается; 13 С ЯМР (100 МГц, CDCl 3 ): δ169,4 (С), 162,1 (С), 127,1 (С), 121,2 (СН), 79,8 (СН), 61,9 (СН 2 ), 61,8 (СН), 25,9 (3 х Ме), 24,7 (Ас), 18,3 ( C (Me) 3 ), -5,3 (Si-Me), -5,4 (Si-Me).

3. Результаты и их обсуждение

Фурфурол 3, полученный из 3A5AF [ 18 ], был превращен в оксим 4 (без очистки), что после дегидратации позволило получить 2-циано-3A5AF 5 с превосходным выходом в течение трех стадий (Схема 3 ) . По нашему опыту, гидролиз ацетамидом производных 3A5AF протекает плохо в водных условиях, что часто приводит к значительному разложению из-за требуемых повышенных температур. Мы обнаружили, что метанолиз, опосредованный безводной кислотой, более надежен, поскольку он протекает при более низких температурах. Метанолиз ацетамида оказался успешным с получением 6, но спектроскопический анализ ЯМР показал, что также происходил гидролиз нитрила, которому способствовала вода, образующаяся при реакции HCl с MeOH. Несмотря на этот непредсказуемый результат, мы подвергли6 к гетероаннеляции с формамидином с получением фуро[3,2- d ]пиримидин-4-она с 7 . Хотя фуро[3,2- d ]пиримидин-4-оны не были первоначально намеченной мишенью, они нашли применение в медицинских программах, нацеленных на белок веретена кинезина [ 39 ] и убиквитиновую протеасомную систему 7 (USP7) [ 40 ].
Химия 05 00135 sch003
Схема 3. Синтез фуро[3,2- d ]пиримидин-4-она 7 .
Первоначальный план имел ограничения, поскольку мы не ожидали легкого гидролиза нитрила в 5 . В поисках первоначальной цели — фуро[3,2- d ]пиримидин-4-аминного каркаса — в качестве субстрата было выбрано производное аминокислоты хитина метил-4-ацетамидофуран-2-карбоксилат (M4A2C) [ 16 ]. что сложный эфир с меньшим электроноакцептором снижает реакционную способность нитрила, делая его менее восприимчивым к гидролизу ( Схема 4 А). Формилирование M4A2C по Вильсмайеру привело к образованию фурфурола 8 , который был превращен в 2-цианофуран 10 (через оксим 9) с отличным общим выходом. Влияние эфира на M4A2C было убедительным; метанолиз избирательно расщепил ацетамид в 9 , оставив цианогруппу нетронутой. Наконец, гетероаннеляция формамидином привела к образованию фуро[3,2- d ]пиримидин-4-амина 12 . В продуктах 7 и 12 только один атом азота получен из хитина. Однако гидроксиламин можно считать биогенным; он является продуктом процесса нитрификации и широко распространен в природе [ 41 ]. Формамидин доступен из природного продукта цианамида [ 42 , 43 ], который сам биосинтезируется из аминокислоты L -канаванина [42, 43].44 ] ( схема 4 Б). Также возможно, что биогенный формамидин может быть получен при превращении мочевины в тиомочевину с последующей восстановительной десульфуризацией [ 45 ].
Химия 05 00135 sch004
Схема 4. ( А ) Синтез фуро[3,2- d ]пиримидин-4-амина 12 из M4A2C; ( Б ) формамидин и гидроксиламин представляют собой N -соединения, существующие в природе.
Синтез фуро[3,2- d ]пиримидин-4-амина 12 и фуро[3,2- d ]пиримидин-4-она 7 из 3A5AF расширил гетероароматическое химическое пространство, доступное из хитина. Мы также хотели бы сообщить о наших предварительных результатах по расширению окислительного кольца синтона хирального пула ди-HAF. Ранее мы сообщали о синтезе энантиообогащенных 2-аминосахаров из 3A5AF [ 20 ]; однако этот метод имеет некоторые недостатки ( схема 5 А). Введение искусственной хиральности с использованием восстановления Нойори было затруднительным (50 °C, время реакции 1 неделя) при получении фурфурилового спирта 13, так как при расширении окислительного кольца он давал N -ацетил -l .-красноносый (RedNAc). Отсюда было доступно несколько 2-аминосахаров, но все они содержали метильную группу в С5, которая ограничивала модификации в этом сайте. Ожидалось, что эти недостатки можно будет преодолеть, если полученный из хитина синтон ди-HAF хирального пула успешно подвергнется реакции Ахматовича; не только природная хиральность, присутствующая в хитине, будет передана продукту (таким образом устраняя необходимость восстановления Нойори), но и полученный 2-аминосахар 14 будет обладать универсальной гидроксиметильной группой в положении C5 ( схема 5 B). Более того, 14 представляет собой новый каркас из 2-аминосахаров, который может быть сложно получить из N -ацетил- d -глюкозамина (GlcNAc) [ 46 ,47 , 48 , 49 ].
Химия 05 00135 sch005
Схема 5. ( А ) Синтез 2-аминосахаров из 3A5AF; ( B ) Предполагаемое окислительное расширение кольца ди-HAF. Структура GlcNAc показана для сравнения.
Чтобы облегчить обращение с ожидаемыми продуктами, ди-HAF был моносилилирован по первичному спирту с получением 15 , а также небольших количеств его региоизомера, который нельзя было разделить с помощью колоночной хроматографии ( схема 6 ). Перегруппировка Ахматовича прошла гладко и привела к получению несколько нестабильного 2-аминосахара 16 с хорошим выходом. Окисление лактола помогло стабилизировать каркас, давая дион 17 . Восстановление Luche в C4-кетоне обеспечило 18 с хорошей диастереоселективностью, а структура основного син- диастереомера была подтверждена рентгеноструктурным анализом ( рис. 1 ).
Химия 05 00135 sch006
Схема 6. Применение ди-HAF в перегруппировке Ахматовича ( R = трет -бутилдиметилсилил; TBDMS).
Химия 05 00135 г001
Рисунок 1. Молекулярная структура 2-аминосахара 18 (CCDC 2285900). Параметры смещения атомов были нарисованы с уровнем вероятности 50%.
В заключение можно сказать, что доступ к дополнительному биогенному N -химическому пространству осуществляется с хитиновых платформ 3A5AF, M4A2C и di-HAF. Высокоценные гетероароматические каркасы фуро[3,2- d ]пиримидин-4-он 7 и фуро[3,2- d ]пиримидин-4-амин 12 могут быть селективно получены из биогенных N -платформ 3A5AF и M4A2C соответственно. . Более того, хиральный каркас ди-HAF является жизнеспособным субстратом для перегруппировки Ахматовича, генерируя новые, энантиообогащенные 2-аминосахарные химические вещества, обладающие хиральными центрами, которые можно проследить до биополимера хитина, при этом все продукты обладают универсальной 5-гидроксиметильной ручкой в ​​​​С5.

Дополнительные материалы

Следующую вспомогательную информацию можно загрузить по адресу: https://www.mdpi.com/article/10.3390/chemistry5030135/s1 . Спектры ЯМР всех новых соединений и данные рентгеноструктурного анализа 18 .

Вклад автора

Концептуализация, JS; Методология, TAR, JCN и SPJ; Валидация, JCN; Формальный анализ, TAR, JCN, SPJ и TS; Расследование, TAR, JCN и SPJ; Курирование данных, TAR, SPJ, TS и JS; Написание — оригинальный черновик, JS; Супервизия, JS; Администрирование проекта, JS; Приобретение финансирования, JS и JCN. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Мы благодарим Оклендский университет за присуждение докторской стипендии (JCN).

Заявление о доступности данных

Кристаллографические данные для 2-аминосахара 18 , представленные в этой статье, депонированы в Кембриджском центре структурных данных под номером депонирования CCDC 2285900. Копии данных можно получить бесплатно через https://www.ccdc.cam.ac. uk/structures/ (по состоянию на 7 августа 2023 г.). Все остальные соответствующие данные содержатся в этой статье и дополнительных материалах .

Благодарности

Мы благодарны Тимоти Кристоферу за сбор данных рентгеноструктурного анализа монокристаллов.

Конфликт интересов

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Рекомендации

  1. Кириаку, В.; Гарагунис, И.; Вуррос, А.; Василейу, Э.; Стукидес, М. Электрохимический процесс Габера-Боша. Джоуль 2020 , 4 , 142–158. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  2. Песня, X.; Башир, К.; Заре Р.Н. Получение аммиака из микрокапель азота и воды. Учеб. Натл. акад. наук. США 2023 , 120 , e2301206120. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  3. Соловейчик Г. Электрохимический синтез аммиака как потенциальная альтернатива процессу Габера – Боша. Нат. Катал. 2019 , 2 , 377–380. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  4. Ван, М.; Хан, Массачусетс; Мохсин, И.; Уикс, Дж.; ИП, АХ; Сумон, Казахстан; Динь, Коннектикут; Сарджент, Э. Х.; Гейтс, ID; Голам Кибрия, М. Могут ли устойчивые пути синтеза аммиака конкурировать с процессами Габера-Боша на основе ископаемого топлива? Энергетическая среда. наук. 2021 , 14 , 2535–2548. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  5. Ян, Н.; Чен, X. Устойчивое развитие: не выбрасывайте отходы морепродуктов. Природа 2015 , 524 , 155–157. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  6. Халси, MJ; Ян, Х.; Ян, Н. Устойчивые пути синтеза возобновляемых химикатов, содержащих гетероатомы. АСУ Сустейн. хим. англ. 2018 , 6 , 5694–5707. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  7. Дай, Дж.; Ли, Ф.; Фу, X. На пути к биопереработке Shell: достижения в химико-каталитической конверсии хитиновой биомассы в азоторганические химикаты. ChemSusChem 2020 , 13 , 6498–6508. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  8. Осада, М.; Кикута, К.; Ёсида, К.; Тотани, К.; Огата, М.; Усуи, Т. Некаталитический синтез хромогенов I и III из N-ацетил-D-глюкозамина в высокотемпературной воде. Зеленая химия. 2013 , 15 , 2960–2966. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  9. Течикавара, К.; Кобаяши, Х.; Фукуока, А. Превращение N-ацетилглюкозамина в защищенную аминокислоту на катализаторе Ru/C. АСУ Сустейн. хим. англ. 2018 , 6 , 12411–12418. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  10. Боббинк, Флорида; Чжан, Дж.; Пирсон, Ю.; Чен, X.; Ян, Н. Превращение производного хитина N-ацетил-D-глюкозамина (NAG) в полиолы с использованием катализаторов на основе переходных металлов и водорода в воде. Зеленая химия. 2015 , 17 , 1024–1031. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  11. Никахд, М.; Микусек, Дж.; Ю, Л.-Ж.; Кут, ML; Банвелл, Миннесота; Ма, К.; Гардинер, М.Г. Использование хитина как источника биологически фиксированного азота: образование и полная характеристика низкомолекулярных гетеро- и карбоциклических продуктов пиролиза. Дж. Орг. хим. 2020 , 85 , 4583–4593. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  12. Банвелл, Миннесота; Поллард, Б.; Лю, X.; Коннал, Лос-Анджелес. Использование самых распространенных в природе полимеров: разработка новых путей преобразования целлюлозы, гемицеллюлозы, лигнина и хитина в платформенные молекулы (и за их пределами). хим. Азиатский журнал, 2021 , 16 , 604–620. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  13. Гомес, РФА; Гонсалвеш, BMF; Андраде, KHS; Соуза, BB; Маулид, Н.; Бернард, GJL; Афонсо, CAM Раскрытие потенциала фурановых платформ на биологической основе, богатых азотом, в качестве синтонов биомассы. Энджью. хим. Межд. Эд. 2023 , 62 , e202304449. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  14. Падован, Д.; Кобаяши, Х.; Фукуока, А. Простое получение 3-ацетамидо-5-ацетилфурана из N-ацетил-d-глюкозамина с использованием коммерчески доступных солей алюминия. ChemSusChem 2020 , 13 , 3594–3598. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  15. ван дер Лоо, CHM; Борст, MLG; Паувер, К.; Миннаард, А.Дж. Дегидратация N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) до энантиочистого дигидроксиэтилацетамидофурана (Di-HAF). Орг. Биомол. хим. 2021 , 19 , 10105–10111. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  16. Садик, AD; Чен, X.; Ян, Н.; Сперри, Дж. На пути к биоперерабатывающему заводу Shell: устойчивый синтез противоракового алкалоида проксимицина А из хитина. ChemSusChem 2018 , 11 , 532–535. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  17. Фам, ТТ; Линдси, AC; Чен, X.; Гезайдин, Г.; Ян, Н.; Сперри, Дж. Перенос биовозобновляемого азота, присутствующего в хитине, в несколько N-функциональных групп. Поддерживать. хим. Фарм. 2019 , 13 , 100143. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  18. Фам, ТТ; Линдси, AC; Ким, Южный-Западный; Перселло, Л.; Чен, X.; Ян, Н.; Сперри, Дж. Двухэтапное получение разнообразных 3-амидофуранов из хитина. ChemistrySelect 2019 , 4 , 10097–10099. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  19. Фам, ТТ; Чен, X.; Ян, Н.; Сперри, Дж. Новый дигидродифуропиридиновый каркас, полученный из кетонов и гетероцикла, полученного из хитина, 3-ацетамидо-5-ацетилфурана. Монатш. хим. 2018 , 149 , 857–861. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  20. Фам, ТТ; Гезайдин, Г.; Зёнель, Т.; Ян, Н.; Сперри, Дж. Окислительное расширение кольца платформы, полученной из хитина, обеспечивает доступ к неизведанному химическому пространству 2-аминосахаров. Евро. Дж. Орг. хим. 2019 , 2019 , 1355–1360. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  21. Фам, ТТ; Чен, X.; Зёнель, Т.; Ян, Н.; Сперри, Дж. Хабер-независимый, ориентированный на разнообразие синтез азотных соединений из биовозобновляемого хитина. Зеленая химия. 2020 , 22 , 1978–1984. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  22. Невилл, Джей Си; Лау, МОЙ; Зёнель, Т.; Сперри, Дж. Хабер-Независимый асимметричный синтез морского алкалоида эпи-лептосферина из синтона хирального пула, полученного из хитина. Орг. Биомол. хим. 2022 , 20 , 6562–6565. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  23. Перейра, Дж.Г.; Раваско, JMJM; Вейл, младший; Кведа, Ф.; Гомес, RFA Прямая реакция Дильса-Альдера с получением 3-ацетамидо-5-ацетилфурана из хитина. Зеленая химия. 2022 , 24 , 7131–7136. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  24. Сантос, CS; Родини Маттиоли, Р.; Соарес Баптиста, Ж.; Менезес да Силва, В.Х.; Браун, DL; Пастре, Дж. К. Азотированные ароматические соединения из хитина. Зеленая химия. 2023 , 25 , 5059–5067. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  25. ван дер Лоо, CHM; Шим ван дер Лофф, Р.; Мартин, А.; Гомес-Сал, П.; Борст, MLG; Паувер, К.; Миннаард, А.Дж. π-фациальная селективность в реакции Дильса-Альдера хиральных фуранов и малеимидов на основе глюкозамина. Орг. Биомол. хим. 2023 , 21 , 1888–1894. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  26. Икегами, С.; Исомура, Х.; Цучимори, Н.; Хамада, К.; КОБАЯСИ, Х.; Кодзима, Ю.; Осано, Ю.Т; Кумадзава, С.; Мацузаки, Т. Кристаллическая структура ингибитора эмбрионального развития морских звезд, 4-оксо-7-(β-D-рибофуранозил)-3H-фуро[3, 2-d]пиримидин: пересмотр структуры пирролозина. Анальный. наук. 1992 , 8 , 897–898. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  27. Бхаттачарья, БК; Лим, М.-И.; Выдра, бакалавр искусств; Кляйн, Р.С. Синтез фуро[3,2-d]пиримидиновых нуклеозидов: новый c-нуклеозидный изостер аденозина. Тетраэдр Летт. 1986 , 27 , 815–818. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  28. Бхаттачарья, БК; Выдра, бакалавр искусств; Беренс, РЛ; Кляйн, Р.С. Исследования по синтезу фуро[3,2-d]пиримидин-С-нуклеозидов: новые аналоги инозина с антипротозойной активностью. Нуклеозиды Нуклеотиды 1990 , 9 , 1021–1043. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  29. Хоеманн, М.; Уилсон, Н.; Аргириади, М.; Банах, Д.; Бурчат, А.; Колдервуд, Д.; Клэпхэм, Б.; Кокс, П.; Дуиньян, Д.Б.; Конопацкий, Д.; и другие. Синтез и оптимизация фурано[3,2-d]пиримидинов как селективных ингибиторов тирозинкиназы селезенки (Syk). Биоорг. Мед. хим. Летт. 2016 , 26 , 5562–5567. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  30. Кошизава, Т.; Моримото, Т.; Ватанабэ, Г.; Ватанабэ, Т.; Ямасаки, Н.; Савада, Ю.; Фукуда, Т.; Окуда, А.; Сибуя, К.; Огия, Т. Оптимизация новой серии мощных и перорально биодоступных агонистов GPR119. Биоорг. Мед. хим. Летт. 2017 , 27 , 3249–3253. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  31. Хэнкокс, Техас; Пегг, Северная Каролина; Надин, Эй Джей; Прайс, С. Фармацевтические соединения. Патент WO2008152394, 12 июня 2008 г. [ Google Scholar ]
  32. Роудс, Дж.; Майдолл, М.; Цой, И.Ю.; Копец Б. Методы и лечение вирусной инфекции замещенными фуро-пиримидинами. Патент WO2022261068, 8 июня 2021 г. [ Google Scholar ]
  33. Ким, С.; Хонг, Дж. Х. Синтез новых 4'-трифторметил-5'-норкарбоциклических C-нуклеозидфосфоновых кислот в качестве мощных противолейкемических средств. Нуклеозиды Нуклеотиды Нуклеиновые Кислоты 2015 , 34 , 848–865. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  34. Бутора, Г.; Олсен, Д.Б.; Кэрролл, СС; МакМастерс, доктор медицинских наук; Шмитт, К.; Леоне, Дж. Ф.; Сталхут, М.; Бурлейн, К.; МакКосс, М. Синтез и ингибирующие ВГС свойства 9-деаза- и 7,9-дидеаза-7-окса-2'-C-метиладенозина. Биоорг. Мед. хим. 2007 , 15 , 5219–5229. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  35. Шелдрик, генеральный директор Краткая история SHELX. Акта Кристаллогр. Секта. А, 2008 , 64 , 112–122. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  36. Бурхис, LJ; Доломанов О.В.; Гильдеа, Р.Дж.; Ховард, JAK; Пушманн, Х. Анатомия комплексной ограниченной программы усовершенствования современной вычислительной среды - анализ Olex2. Акта Кристаллогр. Секта. А 2015 , 71 , 59–75. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  37. Доломанов О.В.; Бурхис, LJ; Гильдеа, Р.Дж.; Ховард, JAK; Пушманн, Х. OLEX2: Полное структурное решение, программа уточнения и анализа. Дж. Прил. Кристаллогр. 2009 , 42 , 339–341. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  38. Макрэ, CF; Соваго, И.; Коттрелл, С.Дж.; Галек, ОТА; Маккейб, П.; Пидкок, Э.; Платингс, М.; Шилдс, врач общей практики; Стивенс, Дж. С.; Таулер, М.; и другие. Меркурий 4.0: от визуализации к анализу, проектированию и прогнозированию. Дж. Прил. Кристаллогр. 2020 , 53 , 226–235. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  39. Теоклиту, М.-Э.; Акила, Б.; Блок, Миннесота; Бразил, ПиДжей; Кастриотта, Л.; Код, Э.; Коллинз, член парламента; Дэвис, AM; Диган, Т.; Эжутачан, Дж.; и другие. Открытие (+)-N-(3-аминопропил)-N-[1-(5-бензил-3-метил-4-оксо-[1,2]тиазоло[5,4-d]пиримидин-6-ил )-2-метилпропил]-4-метилбензамид (AZD4877), ингибитор белка кинезинового веретена и потенциальный противораковый агент. Дж. Мед. хим. 2011 , 54 , 6734–6750. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  40. О'Дауд, ЧР; Хелм, доктор медицины; Раунтри, JSS; Флаз, Дж. Т.; Аркудис, Э.; Миэль, Х.; Хьюитт, PR; Джордан, Л.; Баркер, О.; Хьюз, К.; и другие. Идентификация и структурно-ориентированная разработка ингибиторов USP7 на основе пиримидинона. АКС Мед. хим. Летт. 2018 , 9 , 238–243. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  41. Чжан, Д.; Ли, В.; Хуанг, X.; Цинь, В.; Лю, М. Удаление аммония из поверхностных вод при низкой температуре недавно выделенной микробактерией Sp. Штамм SFA13. Биоресурс. Технол. 2013 , 137 , 147–152. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  42. Одо, К.; Итикава, Э.; Шираи, К.; Сугино, К. Примечания — новый метод получения формамидина. Дж. Орг. хим. 1957 , 22 , 1715. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]
  43. Камо, Т.; Хирадате, С.; Фуджи, Ю. Первое выделение природного цианамида как возможного аллелохимического вещества из вики волосатой Vicia Villosa. Дж. Хим. Экол. 2003 , 29 , 275–283. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  44. Камо, Т.; Сакурай, С.; Яманаси, Т.; Тодороки, Ю. Цианамид биосинтезируется из L-канаванина в растениях. наук. Rep. 2015 , 5 , 10527. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  45. Браун, DJ Новый синтез формамидина. Дж. Прил. хим. 1952 , 2 , 202–203. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  46. Пфрэнгл, Ф.; Рейссиг, Х.-У. Аминосахара и их миметики через 1,2-оксазины. хим. Соц. Ред. 2010 г. , 39 , 549–557. [ Академия Google ] [ CrossRef ] [ PubMed ]
  47. Эммади, М.; Кулкарни, С.С. Последние достижения в синтезе бактериальных строительных блоков редких сахаров и их применения. Нат. Прод. Республика 2014 , 31 , 870–879. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  48. Скарбек, К.; Милевска, М.Дж. Биосинтетический и синтетический доступ к аминосахарам. Углевод. Рез. 2016 , 434 , 44–71. [ Академия Google ] [ CrossRef ]
  49. Ян, Дж.; Се, Д.; Ма, X. Последние достижения в химическом синтезе аминосахаров. Молекулы 2023 , 28 , 4724. [ Академика Google ] [ CrossRef ]

Категория: Блог
Просмотров: 584

Гиперспектральные изображения пластмасс и фильтрующих подложек были собраны в виде кубов данных в БИК-диапазоне (900-1700 нм) с использованием настольной системы HSI с геометрией отражения.

Медиафайлы

Загрязнение микропластиком стало актуальной проблемой, поскольку оно негативно влияет на экосистемы.Однако эффективные методы обнаружения и характеристики микропластичных частиц все еще находятся в разработке. четкие спектральные характеристики при 1150-1250 нм, 1350-1450 нм и 1600-1700 нм, что позволяет их автоматическое распознавание и идентификацию с помощью алгоритмов спектрального разделения. Используя улучшенную систему гиперспектральной визуализации, мы продемонстрировали обнаружение трех типов микропластичных частиц: полиэтилена, полипропилена и полистирола диаметром до 100 мкм

В диапазоне длин волн 900-1700 нм 11 подлинных образцов пластикового полимера продемонстрировали отличительные характеристики поглощения в трех конкретных диапазонах длин волн: 1150-1250 нм, 1350-1450 нм и 1600-1700 нм. Различные пластиковые полимеры демонстрировали, по-видимому, разные спектральные характеристики. В частности, полиэтилен, наиболее широко используемый пластиковый полимер с наибольшим годовым производством, показал две основные характеристики поглощения при 1195-1225 нм и 1385-1420 нм, сопровождающиеся двумя другими отклонениями от базового уровня при 1150 нм и 1550 нм. ПП показал различные схемы отражения при 1185-1230 нм и 1390-1420 нм. Для сравнения, спектры PS и ABS имели схожие характерные особенности при ∼1130-1160 нм, 1195-1215 нм и 1400-1420 нм. Результаты исследования основных спектральных характеристик PE, PP и PS показали дополнительные различимые особенности с более высоким разрешением по длине волны при 2,5 нм по сравнению с 12 нм и 10 нм.

Категория: Блог
Просмотров: 610

Гиперспектральные изображения используются для обнаружения утечки нефти и определения ее характерных особенностей, и тогда успех распространения или смягчения последствий предопределен.

Гиперспектральные изображения используются для обнаружения утечки нефти и определения ее характерных особенностей, и тогда успех распространения или смягчения последствий предопределен. Шаги для достижения этой цели следующие:
a. Прогнозирование направления распространения разлива нефти и характеристик расхода
Анализ гиперспектральных изображений разлива нефти должен проводиться вовремя для оперативного мониторинга окружающей среды
. Анализируя временное изображение HSI в воздухе, мы можем предсказать, как разлив нефти распространится по водным
объектам, исходя из текущих условий окружающей среды и какие чувствительные участки могут быть затронуты.
б. Реорганизация свойств и интенсивности береговой линии разлива нефти
HSI с высоким спектральным и пространственным разрешением может использоваться для обнаружения свойств береговой линии и
областей, разрушенных из-за утечки нефти. Необходимо исследовать затронутые экологически чувствительные районы, включая заболоченные территории
с мелководьем, водорослями, солончаками, приливными равнинами, каналами или песчаными береговыми линиями с замечательным
биоразнообразием, поскольку эти районы экологически чувствительны.
c. Определение типа загрязняющего вещества
По характерным признакам нефти (e.например, типы нефти и уровень концентрации) важны и могут быть использованы для выбора наилучшего метода очистки, для оценки
экологических последствий сжигания нефти и для моделирования явлений утечки нефти (таких как прогнозирование пути потока, скоростей рассеивания и времени до того, как пятно достигнет берега). Например, скорость испарения легкой нефти выше по сравнению с сырой нефтью, в то время как она может быть более ядовитой для различных морских видов.

Категория: Блог
Просмотров: 727

Методика подготовки рентгенофлуоресцентного спектрального анализа. После сушки, измельчения и перемешивания порошок смешивают с флюсом, помещают в специальный тигель (сплав Pt 95%, Au 5%), с 1000 до 1200 град С высокотемпературный нагрев и плавление, после охлаждения до получения однородной, гладкой и образцы плоского стекла. Существует четыре широко используемых флюса: безводный борат лития и метаборат лития или их смесь в соответствии с определенной пропорцией смешанного флюса и т. д.


Иногда добавляют флюс, такой как безводная литий-борная кислота, метаборат лития или их смесь в соответствии с определенной пропорцией смеси, и добавляют небольшое количество разделительного агента, такого как бромид аммония, бромид лития, йодид калия и т. д. Типы и требования к анализу качества и выбору образца и коэффициенту потока температуры плавления в качестве образца. Прототип имеет высокочастотный и электрический нагрев. Устранено влияние размера частиц, минерального и структурного влияния на размер частиц, минеральное и структурное влияние в рентгенофлуоресцентном анализе, повышена точность и достоверность основных и второстепенных элементов (особенно легких элементов).


Кроме того, в соответствии с расплавленным образцом калибровочные образцы были приготовлены с использованием реагента высокой чистоты в определенной пропорции, чтобы решить проблему отсутствия стандартного материала в некоторых видах образцов. Большое количество производственных процессов из-за потока разбавления, элементного анализа увеличивает интенсивность линии и снижает фоновую интенсивность, для микроэлементов (особенно микроэлементов) и предела обнаружения.

как-подготовить-xrf-плавленый шарик-образец

  1. В чем разница между сплавом и пресс-образцом для XRF
  2. Что такое огневая купеляционная пробирная печь
  3. Глоссарий по лазерам 2
  4. Лазеры Глоссарий 1